线粒体功能障碍在脓毒症中的作用：新进展?

介绍

脓毒症是一种由宿主对感染的反应失调引起并导致多器官衰竭（MOF）的威胁生命的疾病。有脓毒症无合并症的病人病死率为25％，如发生MOF病死率可达80％，使其成为重症监护病房（ICU）死亡的主要原因。尽管数十年来众多研究人员致力于脓毒症发病机制的研究，有关脓毒症相关MOF的确切机制尚未得到阐明。

20世纪70年代，失血性低血容量及大肠杆菌内毒素休克大鼠模型的研究，首次证实了脓毒性休克中线粒体功能的抑制状态。但随后的研究却产生了矛盾的结果，在20年后线粒体功能障碍概念被确认是导致脓毒症发病机制的重要机制，并在动物和人类的研究得到了证实。线粒体的功能和超微结构异常在肝脏，肾脏和骨骼/心肌中都被证实存在，后来在血细胞中发现了这一现象。同时还发现了线粒体功能障碍与氧化应激有关，这是一种氧化还原失衡状态，和活性物质和/或自由基的过量产生以及抗氧化剂的消耗有关。此后，此种关联引发了更多关于寻找脓毒症潜在治疗靶点的研究。

本章重点介绍了近期有关线粒体功能障碍及其氧化应激作用方面的发现和假说，有助于解释其在脓毒症发病机制中的重要作用。未来将可能有助于探索针对线粒体或氧化应激新的的治疗方法。

线粒体：细胞的发动机及更多功能

在回顾脓毒症线粒体功能障碍之前，了解线粒体在健康细胞中的生理功能非常重要。除外红细胞，线粒体存在于人体的所有细胞类型中，尽管每个细胞内的线粒体数量都不尽相同。来自较高能量需求的肝脏和肌肉组织的细胞通常比其他组织类型的细胞含有更多的线粒体。线粒体的主要功能是产生三磷酸腺苷（ATP），这是大多数细胞活动如细胞分裂，细胞信号传导和肌肉收缩等所必需的主要的能量载体。部分ATP可通过糖酵解在细胞液中产生，但大多数ATP还是通过氧化磷酸化在线粒体中产生，因为比前者更高效。在氧气参与下，营养底物被氧化磷酸化过程氧化释放用于ATP产生的能量。该过程涉及电子从三羧酸（TCA）循环（也称为Krebs循环）转移到线粒体内膜上的一系列酶复合物（复合体I-IV）组成的电子传递链上。随着电子沿电子传输链向下游移动，质子被泵运送穿膜，形成质子梯度；该梯度为ATP合酶（复合体V）提供能量以将二磷酸腺苷（ADP）磷酸化为ATP，线粒体氧化磷酸化的氧消耗占全身氧消耗的90％以上，但并非线粒体消耗的所有氧气都用于ATP产生。部分氧气与能量产生脱钩用于产生活性氧物质（ROS）（约占总氧气的1-2％）或产生热量。ROS的产生主要发生在电子传递链中，其中复合体I和III处的电子泄漏导致氧的不完全还原而成超氧化物。通过内源性抗氧化系统（包括锰超氧化物歧化酶（MnSOD），谷胱甘肽和硫氧还蛋白）来控制健康状态下线粒体中的ROS水平；ROS和抗氧化剂之间的良好平衡对于线粒体和细胞的整体健康至关重要。

除能量产生外，细胞中线粒体的其他作用还包括产热，细胞内的钙调节，细胞凋亡和细胞内信号传导，使线粒体成为维持正常细胞功能的重要细胞器。

脓毒症和线粒体功能障碍：适者生存

脓毒症是由宿主对感染的免疫应答失调引起的，可导致全身性炎症反应综合征（SIRS），并可发展成为MOF（多脏器功能不全）和脓毒性休克（脓毒症伴低血压）。

脓毒症相关的MOF相当复杂，涉及放大的炎症反应，微循环改变和线粒体功能障碍。然而，针对促炎介质如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-1（IL-1）的靶向疗法并未能显示对脓毒症患者有任何益处。正常的微循环对于充分的组织氧合是必需的，因此任何对于微循环的破坏都可导致组织缺氧，从而直接影响器官功能。虽然已经证明微循环改变在脓毒症相关的MOF中起重要作用，但在受影响的器官中很难准确评估。尸检发现心脏、肝脏、脑和肾等器官的细胞死亡率是最低的，这使得进一步验证变得困难。

在20世纪70年代早期，从内毒素模型分离的线粒体功能的测量研究表明肝脏、心脏和骨骼肌线粒体中的能量代谢是被抑制的。由于从大肠杆菌中提取的内毒素（脂多糖[LPS]）的作用，在电子显微镜下观察到线粒体氧化呼吸减少及线粒体的肿胀。自20世纪90年代后期以来，脓毒症中的线粒体功能障碍受到越来越多的关注，当时首次提出细胞病理性缺氧（细胞水平的氧气供应减少）是导致组织缺氧从而导致脓毒症的MOF的可能机制。因此，脓毒症中的组织缺氧，被首先认为是由微循环破坏引起的，但却不能解释组织氧张力的增加 。在受脓毒症影响的各种器官的尸检样本中很少观察到细胞死亡，反而是存活者器官功能的恢复期中可见到。然而，脓毒症中观察到的组织氧张力的增加可以通过细胞病理性缺氧或线粒体功能障碍来解释，其表示尽管细胞内有正常或超常的氧可用性，但ATP点产生和氧消耗仍可能减少。通过降低骨骼肌中的ATP浓度和抑制电子传递链复合体I的活性证明ATP的产生减少与脓毒性休克的严重程度和预后相关，这与脓毒症动物模型中的早期发现是一致的。进一步有证据表明，与对照组相比，重症患者的复合体I和复合体IV亚基的蛋白质水平显着降低，并且在重症患者中也观察到氧化磷酸化转录物丰度的总体性降低。此外，已经发现存活者的氧化磷酸化转录本丰度高于非存活者。所有这些证据表明，由于氧化磷酸化复合物受损，失代偿器官的细胞减少了用于ATP产生的氧气用量。

然而，关于为什么在尸检样本中很少检测到细胞死亡而MOF存活者的器官功能恢复期却仍发现细胞病理缺氧或线粒体功能障碍等；如前所述，线粒体是细胞内ATP的主要来源，因此理论上如果线粒体功能障碍持续存在，最终将导致细胞死亡，从而导致器官衰竭，这可能是不可逆转的。但是Mervyn Singer的一个有趣的假设表明：脓毒症患者中代谢活性降低（低氧化磷酸化复合物活性和低ATP产生）可导致能量需求降低，这可能是一种模仿冬眠的新稳态。因此，线粒体功能障碍一方面与MOF的发展相关，而其另一方面，很可能是细胞应对脓毒症中严重的全身性炎症反应的适应性机制。因此，生存将依赖于线粒体呼吸功能的恢复；通过线粒体生物合成（新线粒体的合成）恢复线粒体功能已在LPS或金黄色葡萄球菌诱导的几种脓毒症动物模型中得到充分证实。调节线粒体生物合成的基因，如过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子-1α（PGC-1α），线粒体转录因子（Tfam）和核呼吸因子-1（NRF-1），在代谢活动恢复前有上调现象。PGC-1α是转录共激活因子，其通过激活NRF-1和Tfam在调节线粒体生物发生中起重要作用。NRF-1编码转录因子，其激活线粒体呼吸、线粒体DNA转录和复制所需的核基因的表达。Tfam编码线粒体转录因子，它是线粒体转录和线粒体基因组复制的关键激活因子。对重症患者的研究还发现存活者中PGC-1α mRNA的表达增加，而非存活者则没有，这进一步证明了线粒体生物合成在器官功能恢复和最终存活中的重要性。患者是否在MOF中存活将取决于他们的细胞如何快速和有效地切换恢复机制 - 适者生存。

氧化应激和线粒体功能障碍

我们已经详细阐述了线粒体功能障碍在脓毒症相关MOF发病机制中的重要作用。然而，众所周知脓毒症是由宿主对感染的免疫应答失调引起的，其特征在于过度炎症阶段和随后的免疫抑制阶段。在脓毒症的情况下，免疫反应如何影响线粒体和器官的功能呢？考虑到各种抗炎剂未能在脓毒症患者中显示任何有益效果，需要考虑除细胞因子之外的其他介质。

随着脓毒症中促炎细胞因子的过度产生，先天免疫细胞（氧化爆发）也会导致作为身体清除病原体的防御机制的一部分的自由基和活性物质的过量产生，包括ROS和活性氮物质（RNS），其作用类似于抗微生物剂并且可以直接破坏微生物病原体。如前所述，ROS是正常线粒体中氧化磷酸化的副产物，也可以在胞质溶胶，过氧化物酶体和内质网中产生，并在细胞生长，凋亡的调节及信号传导中起重要作用。与ROS类似，RNS也可作为细胞信号传导和基因表达的调节因子。尽管ROS和RNS作为抗微生物剂和细胞过程调节剂具有重要作用，但如果不加以控制，其过量产生可能对细胞有害。控制正常细胞中的ROS水平是通过酶和非酶途径组成的内源性抗氧化系统进行到。酶途径包括超氧化物歧化酶（SOD），谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）和过氧化氢酶，可将ROS转化为水或活性较低的分子。非酶途径包括谷胱甘肽和硫氧还蛋白；控制RNS水平是通过调节一氧化氮合酶（NOS），一种催化从1-精氨酸产生一氧化氮（NO）的酶。

由于ROS / RNS过量产生或抗氧化剂/ NOS抑制不足，ROS / RNS与抗氧化剂/ NOS抑制之间的不平衡产生了一种称为氧化应激的状态，与包括脓毒症在内的几种病理状况有关。一些研究已经证明了氧化应激在脓毒症患者存活中的重要性。脓毒症存活者的抗氧化能力显着高于非存活者，相反，抗氧化能力的缺乏则与死亡率相关。涉及脓毒症发病机理的ROS分子包括超氧化物（O2-），过氧化氢（H2O2）和羟基自由基（HO）。RNS分子包括NO和过氧亚硝酸盐（ONOO-），后者通过NO和O2-之间的反应形成。其中，NO及其衍生物ONOO-是脓毒症研究中及最多的因子，因此将用来作为例子来说明氧化应激在线粒体功能障碍中的作用。

NOS由氨基酸l-精氨酸产生NO，其具有不同的同种型：神经元NOS（nNOS），内皮NOS（eNOS），线粒体NOS（mtNOS）和诱导型NOS（iNOS）。nNOS，eNOS和mtNOS是结构性表达的，而iNOS表达是由感染，炎症或创伤诱导的[33]。线粒体内外均可产生NO，一旦形成，它就可以自由地扩散到线粒体中并发挥其作用。在生理条件下，NO可逆地结合细胞色素c氧化酶的氧结合位点（电子传递链的复合物IV），作为线粒体呼吸的调节剂。在脓毒症等病理条件下，通过干扰素γ（IFNγ），TNF-α和IL-1β的细胞因子诱导通过iNOS活化产生的NO增加。这种iNOS的激活是通过核因子-κB（NF-κB）信号通路，导致几种下游基因的激活，包括那些负责NO和细胞因子产生的基因。过量产生NO会通过几种途径损害线粒体功能：（1）高浓度NO与复合物IV的结合会中断电子传递链，从而抑制线粒体呼吸;（2）由于中断的电子传递链和质子泄漏，增强了ROS的产生，特别是O2?和H2O2（3）由NO和O2?的相互作用形成ONOO-,ONOO?是一种强大的氧化剂和硝化剂，在调节线粒体功能障碍中起着重要作用。事实上，ONOO?导致了NO的大部分细胞毒性作用，其中包括（1）线粒体脂质心磷脂的过氧化，这是线粒体内膜上的一种磷脂，在线粒体生物能量学中发挥重要作用;（2）通过S-亚硝基化或酪氨酸硝化抑制复合物I、其他酶复合物及内源性抗氧化剂，如谷胱甘肽;（3）线粒体DNA的损伤。这些对线粒体脂质，蛋白质和DNA的不利影响将导致线粒体功能障碍并最终导致器官衰竭。

NO和ONOO-对线粒体的影响如图1

图1

脓毒症的潜在疗法：线粒体的未来是什么？

如本章前面所述，线粒体功能障碍与脓毒症患者的疾病严重程度和转归有关，并且氧化应激已被证明是导致线粒体功能障碍的重要因素之一。因此，通过恢复线粒体内氧化剂和抗氧化剂之间的平衡，甚至通过增强其生物合成以恢复线粒体功能，可能是更好地管理脓毒症患者的关键，近期有研究证明几种抗氧化剂或分子可能改善脓毒症患者的预后。一些在人体中进行过测试的有希望的疗法包括抗坏血酸，NOS抑制剂和褪黑激素。抗坏血酸，维生素C的氧化还原形式和天然抗氧化剂，已通过脓毒症患者的I期安全性试验。NOS抑制剂酮舍林(ketanserin)证实对脓毒症患者有益，其微循环灌注得到了改善。褪黑激素是一种在大脑松果腺中产生的激素，具有抗炎和抗细胞凋亡作用。褪黑激素还可作为ROS / RNS清除剂，并已被证明可减少人体内毒素血症模型的炎症和氧化应激标志物。与靶向氧化应激相比，靶向线粒体生物合成策略由于其生物合成途径的复杂性而较少进展；其中包括与线粒体生物合成相关的几种潜在治疗靶标包括本章前面提到的PGC-1α，Tfam和NRF-1。另一种分子丝裂原活化蛋白激酶激酶3（MKK3），也已显示在脓毒症小鼠模型的线粒体生物合成中起重要作用。与非脓毒症对照组相比，在来自脓毒症患者的分离的外周血单核细胞中检测到更高的MKK3活化。除了生物合成，MKK3对于线粒体自噬（去除功能失调的线粒体）也是重要的，这是恢复线粒体功能的重要过程，这些分子值得进一步研究以探索其治疗潜力。最后但仍比较重要的是，线粒体移植是一种用具有呼吸能力的线粒体替代功能障碍的线粒体的新方法，可能为线粒体的恢复过程提供启动功能，特别是在启动生物合成过程能力较弱的患者中。线粒体移植已经在患有先天性心脏病的儿科患者中进行了测试，有小部分患者心肌功能的改善。线粒体移植的治疗用途仍处于早期阶段，但有望恢复脓毒症中的线粒体功能和器官功能。

结论

自20世纪70年代以来，线粒体功能障碍在脓毒症发病机制中的作用引起了很多争议，其作用结果可能由于内毒素血症模型的选择（例如，LPS与活细菌，小动物与大型动物模型）的差异以及模型制造的不同（例如，内毒素或细菌的剂量）差异较大。最近使用临床样本的研究，结合更灵敏的分析和更好的研究设计，使线粒体功能的研究更具可重复性，这将有助于更好地了解线粒体功能障碍的原因及其与脓毒症严重程度和结果的关系；同时这对于未来脓毒症治疗的发展至关重要，因为脓毒症仍然是ICU患者死亡的主要原因。虽然目前临床上使用抗氧化剂证实对脓毒症患者有一定的有益作用；然而针对氧化应激的治疗可能是一把双刃剑。考虑到在正常细胞中观察到的ROS / RNS的生理功能，在评估新疗法的利弊时，如何实现这种精细的平衡是至关重要的。