麻醉研究中神经环路的操控技术简介

全身麻醉的药理作用主要包括可逆的意识丧失、顺行性遗忘、镇痛和对伤害性刺激无体动等。每天有成千上万的人接受全身麻醉，目前在全身麻醉药的分子机制方面已经取得了重大进展。然而，全身麻醉的神经环路机制仍需要进一步探索。越来越多的证据表明全身麻醉相关的觉醒和疼痛调控由大脑中不同的神经环路介导。熟悉研究神经环路的现代工具和技术对于客观分析环路机制具有重要指导意义。

现在很多实验室都在利用操控神经环路来研究啮齿动物全身麻醉相关的行为学指标，如意识丧失和镇痛以及麻醉后大脑的脑电活动。为了让广大麻醉科学研究者，特别是临床的专家对神经环路操控技术有基本的了解以及更好地应用该类方法，2020年6月Anesthesiology杂志在线发表了题为《Manipulating Neural Circuits in Anesthesia Research》的方法学文章，系统地介绍四种常用的神经环路的操控技术：电刺激、局部药理学、光遗传学和化学遗传学，包括了每种技术的优缺点，以及在麻醉研究中的应用示例。

使用此类神经环路调控方法的注意事项    

是否使用了正确的方法

电刺激是刺激特定区域内所有神经元和轴突传递问题的的理想之选；

微注射和微透析是分析特定受体或递质水平问题的理想之选；

光遗传学是短时程（毫秒到秒），高精度激动或抑制不同类型神经元问题的理想之选；

化学遗传学是长时程（分钟到小时）或在多个脑区持续激动或抑制不同类型神经元问题的理想之选；

对观察到的效果是否有任何替代性解释，例如从受刺激区域到非目标靶位的投射或二次药物效应？

是否经过组织学验证了电极、导管或基因改造的准确位置？

是否使用了恰当的对照？

包括以下内容：电刺激 – 研究人员是否刺激了附近的非靶区，以确保观察到的效应是区域特异性的？

微注射或微透析 – 研究人员是否进行了单独的仅注射载体的对照实验？

光遗传学 – 研究人员是否记录光照的神经反应以验证视蛋白的表达和功能？

化学遗传学 – 研究人员是否通过单独的实验确保在缺乏化学遗传学受体表达的动物注射配体是无效的？

图1：操控神经元活动的四种不同的技术。每种技术都通过由膜结合蛋白（包括电压门控蛋白（A）、离子通道（B）或其他视蛋白受体（C）和修饰受体（D）的外源配体而非内源配体来激发或抑制神经活动。由于它们不同的分子机制，这四种技术表现出不同程度的时空性和神经元类型特异性。研究人员可以使用这些技术来操控神经活动，以研究神经环路在一系列生理、行为和认知状态中的作用。               

电刺激      

神经电刺激是一种经典的技术，用于直接激活或抑制特定的脑区，以验证该脑区是否介导了特定的行为和神经生理功能。值得注意的是，电刺激是本文涉及的四种方法中目前在人类用于临床治疗目的的唯一方法（例如，帕金森病和其他神经性疾病的深部脑刺激）。

在神经环路研究中，电刺激方法包括使用立体轴框将电极植入目标脑区。信号发生器通过导线或无线设备连接到电极。当电流通过电极时，神经刺激发生。电流影响附近神经元的膜电位，导致神经兴奋或抑制。电极类型（单极或双极）和电流波形、极性、振幅、频率和持续时间决定了该刺激导致神经元兴奋或抑制。通过增加电流的幅度，可以增加目标区域中受影响神经元的数量（图2A）。

图2：电刺激方法用于操控电极附近的神经元活动。（A） 随着刺激强度的增加，它影响更大范围内的神经元，且与神经元类型无关。（B）电刺激腹侧被盖区可研究其对下游的前额皮质和伏隔核影响。电刺激的强度和位置决定了对下游区域的影响程度。在本文中，三角形表示多巴胺能神经元，圆圈表示非多巴胺能神经元，红色表示神经元的激活，黑色表示神经元活动没有改变。

为了证明电刺激产生的影响是区域特异性的，研究人员必须通过采用适当的实验对照来验证其结果，包括在对照组动物中刺激附近的非目标区域，使用相同的刺激参数不会产生与目标区域相同的效果。在完成电刺激实验后，需进行组织学分析来验证刺激电极的正确放置，并确认受刺激的脑组织没有热损伤。

例如，电刺激促唤醒核团可以诱导动物从全身麻醉中苏醒。在甲基苯甲酸酯（多巴胺的再摄取抑制剂）被证明能促使从连续异氟烷和异丙酚麻醉中苏醒后，大鼠的电刺激研究确定了腹侧被盖区是产生这种效应的潜在位点。虽然多巴胺能神经元存在于腹侧被盖区和邻近的黑质，但只有刺激腹侧被盖区才能诱导从异氟烷和异丙酚麻醉中苏醒[1]。随着电流强度的增加，唤醒效应增强，与脑电图变化一致。同样，对小鼠的研究表明，电刺激谷氨酸能觉醒中枢臂旁核能诱导从异氟烷麻醉中苏醒[2]。有研究报道，电刺激中央丘脑改善了患有严重创伤性脑损伤患者的行为反应能力[3]。表明电刺激逆转麻醉效果的研究可能对意识障碍患者的治疗具有转化应用价值。

电刺激的优点是不需要进行药物或病毒的颅内注射。此外，刺激强度可以精确掌控，以控制影响神经元的数量。但是，电刺激有几个严重的缺点。

1. 长时间传导的高电流会导致电极周围组织的热损伤。这可以通过降低刺激的持续时间和强度来预防。

2. 电刺激是非特异性的神经元调控手段，它会影响电极附近的所有类型神经元，包括轴突通过刺激区域的神经元（图2B）。为了避免非目标刺激，应检查目标区域的神经解剖学，以寻找通过它的潜在轴突束，并且刺激参数应在实验中保持一致，以尽量减少所受影响组织体积的变异性。

3. 来自刺激的电信号伪影会干扰同时进行的神经生理记录，特别是当刺激和记录电极非常接近时，这将很难判断电刺激对受刺激神经元的膜电位和放电模式的确切影响。即使已知输入信号是去极化，如果输入强度大且连续时间长会导致去极化阻滞，也可能产生神经元抑制。因此，在将行为效应归因于刺激区域神经元的兴奋或抑制时，必须谨慎。尽管有这些局限性，电刺激仍然是一种有价值的方法，在临床具有巨大的转化应用潜力。

局部药理学：微注射与微透析      

电刺激有助于确定不同脑区在全身麻醉相关的各种指标方面的作用，但有关局部区域内特定神经递质和受体的信息也至关重要。微注射和微透析是用于操控特定脑区中分子水平的关键技术。

在使用微注射的研究中，需在动物的目标脑区植入导管。通过导管插入一个内部管，直到尖端在目标区域。使用可准确输送非常小体积（通常小于1μl）的专用注射泵，将含药物溶液直接注射到目标脑区中（图3A）。缓慢的给药速度（通常为0.1至2 μl/min）可确保来自微注射的压力不会损伤目标脑区。注射溶液然会扩散远离内部管尖，0.5-μl 体积通常扩散约1毫米远。麻醉剂或受体特异性激动剂和拮抗剂的输注通常涉及微注射技术。在微注射后，可以评估各种行为和神经生理功能。

图3：微注射和微透析通过输注药物或其他物质来操控导管周围或探针尖端附近的神经元活动。此外，微透析可用于从大脑中收集物质样本进行分析。（A） 药物和其他受体激动剂或拮抗剂可以通过微注射输注到小体积（通常小于1 mm3）的脑组织。（B） 微透析用于从大脑中收集药物、神经递质或其他小分子的样本，以测量其浓度或其他分析。与微注射相反，微透析的灌注液与周围的脑组织等渗，没有净输注。（C） 微透析也用于输注药物（通常称为反向微透析）。在微透析和反向微透析中，半渗透膜的孔径及物质的浓度决定了物质扩散到的方向。          

例如，Minert等人通过微注射GABAA受体激动的麻醉药异丙酚和戊巴比妥，以及GABAA受体激动剂麝香酚到中桥脑盖膜区产生了持续的无意识[4]。然而，在后续研究中，他们发现，微注射神经类固醇麻醉药阿法沙龙到中桥脑盖膜区没有明显效果[5]。表明中桥脑盖膜区的特定神经环路在某些麻醉药产生无意识方面起作用。

Gamou等人微注射异丙酚到穹窿周区以研究胆碱能通路在全身麻醉中的作用 [6]。穹窿周区微注射异丙酚诱导了镇静和皮质乙酰胆碱释放减少，类似于异丙酚全身给药。表明穹窿周区胆碱能通路在异丙酚诱导的镇静作用中起到了重要作用。Dong等人发现在连续吸入七氟烷时将食欲素受体激动剂微注射到基底前脑能促使从七氟烷麻醉中恢复，苏醒时间缩短，但不影响麻醉诱导时间 [7]，表明胆碱能和食欲素能通路在麻醉恢复而非诱导期间起作用。

除了研究麻醉药物通过特定脑区影响意识外，微注射还能用于研究全身麻醉药的血流动力学副作用。Hu等人将异丙酚微注射到延髓头端腹外侧区后降低了平均动脉压力和心率；当HCN通道阻滞剂ZD-7288微注射到延髓头端腹外侧区后，异丙醇诱发的这种心血管抑制明显减轻 [8]。表明延髓头端腹外侧区HCN通道在异丙酚诱发的心血管抑制中起重要作用。异丙酚产生的无意识和心血管抑制的机制可能涉及不同脑区的不同受体。

与微注射类似，微透析首先在目标脑区植入导管。然而，不是直接通过内部管提供含药物溶液，而是将微透析探针插入目标脑区。微透析探针是同心管，通过探针中心流入，外圈流出。探头的内侧和外侧在尖端汇合，尖端的外缘由半透膜组成。这种配置不仅可以输注药物，还能收集神经递质和其他小分子（图3，B和C）。人工脑脊髓液或林格液通常以0.3-3 μl/min的速度输注。扩散的物质及方向取决于物质浓度梯度和半渗透膜的孔径大小。由于灌注液是等渗的，在整个过程中，大脑中的液体量保持不变。与微注射相比，微透析不仅能测量提取物质的浓度还能精确预测输注物质浓度。此外，微透析还能以固定浓度进行药物输送并维持数小时。

最近，Pal等人使用微透析表明，在持续吸入七氟烷时，将胆碱能激动剂卡巴胆碱输注到前额皮层可恢复麻醉大鼠的意识 [9] 。然而，微透析输注卡巴胆碱到顶叶皮层或去甲肾上腺素到前额叶或顶叶皮层则无此效果，表明前额皮层的胆碱能系统在调节从麻醉状态的恢复意识中起着重要的作用。一些研究采用了微注射和微透析的组合方式。Baghdoyan等人使用微透析发现，在异氟烷麻醉期间，桥脑网状结构中的GABA水平降低；微注射GABA再摄取抑制剂到桥脑网状结构可导致异氟烷诱导时间延长[10]。

微注射和微透析是研究麻醉药对特定脑区的影响以及特定脑区的分子靶点与麻醉关系的有力工具。使用这些方法，可以将药物的全身给药效果与特异性脑区效果进行比较。此外，微注射和微透析可通过拮抗剂阻断和浓度反应实验来识别受体亚型和效应。然而，与电刺激一样，微注射和微透析也有其局限性。在微透析中，大脑中的提取物通常按分钟顺序进行，限制了这种技术的时间分辨率。微注射的药物从输注点扩散，使其在目标脑区的浓度难以恒定输注。因此，必须进行仅输注载体的对照实验。此外，组织学确认导管位置以及在所使用的浓度范围内谨慎解读实验结果对科学的结论至关重要。尽管有这些注意事项，微注射和微透析是将分子药理学与特定神经环路联系起来的有效工具。

光遗传学      

电刺激、微注射和微透析不能用于激活或抑制特定类型的神经元。每个脑区通常包含一系列不同类型的神经元，因此很难使用这些方法识别某种特定类型神经元的作用。相比之下，光遗传学提供了一种新方法，通过选择性表达光激活离子通道或视蛋白来激活或抑制特定的神经元类型（图4A）。

图4：光遗传学通过光纤激活或抑制表达视蛋白的目标神经元。（A）通过光纤传递的光仅能激活在光路径中表达视蛋白ChR2 的神经元，对缺乏视蛋白表达或不在光传递范围的神经元无作用。（B）通过注射含有视蛋白基因的病毒转染神经元，大约3周后，可以用来自光纤的光来研究下游靶标。          

通过注射含有视蛋白基因的病毒，将其表达在特定脑区的的特定类型神经元中。有多种视蛋白，包括兴奋性视蛋白（通道视紫红质2-ChR2）和抑制性视蛋白（嗜盐菌视紫红质-NpHR，以及古细菌视紫红质-Arch）。将光纤植入该区域，在病毒转染2至3周后，可以通过光纤传输光来操控目标神经元。视蛋白的类型决定了激活所需的波长范围。通过短脉冲发光，能以毫秒级的精度来控制神经元的活动。

例如，Wang等人利用光遗传学发现仅刺激臂旁核中谷氨酸能神经元就足以加速七氟烷麻醉的恢复[11]。同样，Taylor等人通过光遗传学激活腹侧被盖区的多巴胺能神经元能促进从持续异氟烷麻醉中苏醒；在全身性使用多巴胺D1受体拮抗剂后，激活腹侧被盖区多巴胺能神经元不再引起唤醒反应，表明唤醒作用主要由多巴胺D1受体控制的[12]。

在最近的研究中，Xie等人试图找出影响睡眠和麻醉的共同神经环路。利用光遗传学方法激活和抑制下丘脑视上核中麻醉状态下激活的神经元，发现使用ChR2对这些神经元进行光遗传学激活可增加慢波睡眠并延长异氟烷麻醉的恢复时间；另一方面，使用Arch对这些神经元进行光遗传学抑制会导致从异氟烷麻醉中恢复的时间缩短，表明这些神经元有助于维持异氟烷的麻醉作用[13]。

光遗传学不仅能精确操控特定脑区中特定类型神经元的放电，还能影响投射神经元放电。Eban等人通过在腹侧被盖区的多巴胺能神经元中诱导视蛋白表达，在伏隔核中植入光纤，通过照射靶区域来激活从腹侧被盖区到伏隔核的多巴胺能投射神经元（图4B，右下角），证明腹侧被盖区-伏隔核通路在自然睡眠的情况下促进苏醒作用[14]。

尽管光遗传学提供了一种强大的工具来研究神经环路，但该方法也有局限性。并非目标区域中的每个神经元都会表达视蛋白，因此很难确定行为学无变化是环路特性还是视蛋白表达不足。此外，许多类型的神经元均会对抑制表现出回弹放电，使用光遗传学抑制时可能会造成混淆的结果。与电刺激一样，光刺激涉及许多参数，例如光的强度和波长，光脉冲的频率和持续时间以及刺激的总时间。长时间光刺激会加热组织，从而引起与视蛋白激活无关的神经生理作用。抑制神经元活动比激活特定神经元更加困难。仅激活一部分神经元可能足以产生兴奋效应，然而可能需要抑制所有特定神经元才能起抑制效应。为了控制这些变量，通常在体外记录单个神经元的放电速率或膜电压来确认功能性视蛋白的表达。此外，组织学分析至关重要，需通过荧光成像和免疫标记法确认光纤的位置以及视蛋白的表达情况。

化学遗传学      

使目标神经元表达特异性配体激活受体，越来越多的研究正在使用化学遗传学技术。这些受体经过工程改造呈惰性，但能被特定外源性配体激活。该技术包括几种不同类型的改造受体：G蛋白偶联受体、配体门控离子通道、激酶和非激酶类。在一个或多个脑区中靶向表达化学遗传受体后，可以局部或全身给予配体以激活受体（图5）。由于能够全身给予配体，因此可以同时激活或抑制多个脑区，而无需植入光纤。

图5：化学遗传学可通过激活目标神经元上的特异性受体来激活或抑制神经元。（A）仅表达化学遗传学受体的神经元受外源性配体影响。兴奋性化学遗传学受体hM3Dq被其配体氯氮平-N-氧化物激活。（B）与光遗传学类似，化学遗传学需先注射含有化学遗传学受体基因的病毒，大约3周后，可通过全身或局部微注射氯氮平-N-氧化物来激活目标神经元。氯氮平-N-氧化物的给药方法取决于实验需求：需要激活所有转染神经元时全身给药，只需要激活小范围转染神经元时局部微注射。          

最广泛使用的化学遗传工具是DREADDs。DREADDs是改造过的G蛋白偶联受体（hM3Dq介导神经元激活，hM4Di介导神经元抑制），对天然配体乙酰胆碱的亲和力低，对合成配体（如氯氮平-N-氧化物）的亲和力高。氯氮平-N-氧化物结合兴奋性受体（例如hM3Dq），会通过增加细胞内钙水平而产生神经元爆发放电。氯氮平-N氧化物与抑制性受体（例如hM4Di）结合时，通过抑制腺苷酸环化酶使神经元活动抑制。为了在同一动物中实现使用不同配体来激活和抑制相同类型神经元，已引入了基于抑制性κ阿片受体的DREADDs。配体Salvinorin B与基于κ阿片受体的DREADDs结合能抑制腺苷酸环化酶，导致神经元抑制。当基于κ阿片受体的DREADDs与兴奋性hM3Dq受体结合使用时，氯氮平-N-氧化物可以激活被Salvinorin B抑制的同一神经元。

化学遗传学方法已广泛用于全身麻醉的神经环路机制研究。例如，Luo等人通过诱导大鼠臂旁核神经元表达hM3Dq兴奋性DREADDs，发现在丙泊酚和异氟烷麻醉期间激活这些神经元能降低了脑电图的低频（1-4 Hz）功率，并加速麻醉恢复，但是这种干预对麻醉诱导无影响[15]。与Luo等人的结果相反，Wang等人使用Vglut2-Cre转基因小鼠使臂旁核谷氨酸能神经元选择性表达兴奋性或抑制性DREADDs，发现选择性激活臂旁核谷氨酸能神经元会延长七氟烷诱导时间，而减少七氟烷麻醉恢复时间；抑制这些神经元会稍微增加麻醉恢复时间[11]。与非选择性激活相比，激活脑内特定类型神经元可能产生不同的结果。

化学遗传学可以选择性激活或抑制特定脑区的特定神经元。由于其配体可以全身给药，因此不需要颅内植入物，例如电极，导管或光纤。此外，其配体可以提供长达数小时的持久效果，且无需担心因电或热引起的脑组织损伤。然而，化学遗传学也具有明显的局限性。尽管氯氮平-N-氧化物被认为是一种惰性配体，但它会被代谢为抗精神病药氯氮平，具有镇静作用，可能干扰实验结果，特别是使用高剂量的氯氮平-N施用氧化氮（大于5 mg / kg）时。作为氯氮平-N-氧化物的替代配体，一些研究使用了哌拉平和Compound 21。但是，哌拉平也有镇静作用，且已被用于治疗失眠症。 因此，尽可能使用低剂量配体，并在实验设计中使用适当的对照，例如在缺乏DREADD表达的对照动物中使用配体。其次，激活或抑制效果因受体而异，因此对于不同的研究问题选择合适的DREADDs很重要。尽管氯氮平-N-氧化物的作用在腹腔注射后45至50分钟达到峰值，并持续约9小时，但Salvinorin B的作用在皮下注射后不久出现，并持续约1小时。最后，当全身给予配体时，任何表达化学遗传学受体的神经元都会受影响。光遗传学技术可以通过放置光纤来限定特定脑区神经元，但是化学遗传学必须通过小心注射少量病毒来限定受体表达。

目前对麻醉机制的理解正在迅速从受体药理学扩展到神经环路。以上所述的每种技术已用于研究麻醉相关行为和生理。了解这些方法的优缺点能使临床医生和科研工作者能够批判性地评估现有研究结果并准确地运用此类技术。

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