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中科院 | Biomed Pharmacother：微生物组学和靶向代谢组学揭示淫羊藿次苷I在黑色素瘤小鼠模型中的抗肿瘤免疫活性

2021

08/12

微生态

A-

A+

最近的研究报告称，肠道微生物组可以通过调节黑色素瘤患者对抗体免疫疗法的反应来增强全身免疫和抗肿瘤免疫。

编译：微科盟北越城主，编辑：微科盟木木夕、江舜尧。

导读

最近的研究报告称，肠道微生物组可以通过调节黑色素瘤患者对抗体免疫疗法的反应来增强全身免疫和抗肿瘤免疫。在这项研究中，我们发现从淫羊藿中分离出的一种新型抗癌剂淫羊藿次苷I通过调节肠道微生物群和宿主免疫显著显著抑制体内B16F10黑色素瘤的生长。口服淫羊藿次苷I改善了荷瘤小鼠的微生物群落结构，显著恢复了盲肠内乳杆菌属和双歧杆菌属的丰度。我们还发现淫羊藿次苷I提高了微生物群衍生代谢物的水平，如短链脂肪酸(SCFA)和吲哚衍生物，从而促进肠道屏障的修复并减少荷瘤小鼠的全身炎症。淫羊藿次苷I表现出很强的免疫抗肿瘤活性，直接表现为上调荷瘤小鼠外周血中包括CD4+和CD8+ T细胞或NK和NKT细胞在内的多个淋巴细胞亚群。总的来说，这些结果表明，淫羊藿次苷I通过重塑微生物组和宿主免疫调节特性，可以开发为一种抗癌药物。

论文ID

原名：Microbiome analysis combined with targeted metabolomics reveal immunological anti-tumor activity oficariside I in a melanoma mouse model

译名：微生物组学和靶向代谢组学揭示淫羊藿次苷I在黑色素瘤小鼠模型中的抗肿瘤免疫活性

期刊：Biomedicine & Pharmacotherapy

IF：6.529

发表时间：2021.06.02

通讯作者：张利民

通讯作者单位：中国科学院精密测量科学与技术创新研究院

实验设计

结果

1. 淫羊藿次苷I的安全性评估

使用正常小鼠和荷瘤小鼠对淫羊藿次苷I进行组织病理学检查、血液临床化学和身体或组织重量监测的体内安全性评估。结果表明，在灌胃的剂量范围内，淫羊藿次苷I对正常小鼠或荷瘤小鼠均无毒或低毒。

图1 从淫羊藿中分离的淫羊藿苷及其衍生物的化学结构。（A）淫羊藿苷；（B）淫羊藿素；（C）淫羊藿次苷I；（D）淫羊藿次苷II。

2. 淫羊藿次苷I剂量依赖性地抑制肿瘤生长

用不同剂量的淫羊藿次苷I（5、20和80 mg/kg）和DTIC（50 mg/kg）治疗的荷瘤小鼠表现出对肿瘤生长的显著抑制（图2A）具体而言，20 mg/kg体重剂量的淫羊藿次苷I治疗平均使肿瘤缩小51.72%，高于低剂量和高剂量淫羊藿苷次I诱导的31.03%和37.93%，与由DTIC诱导的49.55%结果相似（图2A和B）。淫羊藿次苷I和DTIC处理均显著促进了B16F10小鼠肿瘤组织肿瘤细胞的细胞收缩、核凝聚和坏死（图2E）。淫羊藿次苷I和DTIC给药也抑制了通过抗ki67染色观察到的肿瘤细胞增殖（图2E）。

图2 淫羊藿次苷 I在体内抑制B16F10黑色素瘤的生长。（A）一周内每天用卡尺测量肿瘤体积。（B）测量肿瘤的重量。（C）监测每组的体重。（D）每组肿瘤的代表性图像。（E）各组肿瘤组织中细胞增殖标志物（Ki-67）的代表性H&E染色图像和免疫荧光染色图像 (200X, 比例尺=100 μm)。值表示为平均值±标准差(n= 10)。

3. 淫羊藿次苷I调节肠道微生物群，增加益生菌的丰度

通过16S rRNA基因测序分析，从小鼠的所有盲肠内容物样本中获得了高质量的肠道微生物群序列。微生物α-多样性分析表明，荷瘤小鼠的OTU多样性指数高于正常组。淫羊藿次苷I处理以剂量依赖性方式显著恢复了独特的OTU多样性指数（图3A）。基于Bray-Curtis距离的主坐标分析（PCoA）表明，肿瘤组与正常组之间肠道微生物群落结构发生明显变化（R²= 0.135，P=0.089）；而淫羊藿次苷I治疗恢复了由肿瘤生长诱导而改变的肠道微生物群（图3B）。在肠道微生物群中，我们观察到一些门水平的优势菌群，包括Firmicutes, Bacteroidetes, Actinobacteria, Proteobacteria和Tenericutes（图3C）。值得注意的是，淫羊藿次苷I处理显著恢复了放线菌和厚壁菌门的丰度，这些丰度因肿瘤异种移植而相对减少（图3E和F）。在属水平上，以热图为代表的分层聚类分析表明，正常组和淫羊藿次苷I治疗组表现出肠道微生物群的变化与肿瘤组形成对比（图3D）。最显著的变化是乳杆菌和双歧杆菌，它们在正常组和淫羊藿次苷I治疗组中均显著高于肿瘤组（图3G和H）。与肿瘤组相比，淫羊藿次苷I处理还诱导小鼠盲肠内容物中Firmicutes/Bacteroidetes比例, Adlercreutzia, Turicibacter,Allobaculum和Clostridium的水平更高，Bacteroidetes, Ruminococcus和Bacteroides的水平更低（图3I-L）。此外，两种共生菌与肿瘤重量呈负相关，尤其是乳杆菌。

图3 淫羊藿次苷I调节各组盲肠内容物中的肠道微生物群。（A）基于观察到的OTU的α-多样性分析。（B）基于正常组和肿瘤组以及高剂量淫羊藿次苷I组的Bray-Curtis差异的β多样性指数分析。（C）门水平肠道微生物群的相对丰度。（D）正常组和肿瘤组以及中等和高剂量淫羊藿次苷I组的属水平分类群丰度热图。（E和F）厚壁菌门和放线菌丰度的16SrRNA基因测序分析。（G-L）Lactobacillus, Bifidobacterium,Turicibacter, Adlercreutzia, Ruminococcus和 Bacteroides 的16SrRNA基因测序分析。值表示为平均值±标准差(n = 6-8)。

4. 淫羊藿次苷I改善肠道短链脂肪酸代谢

短链脂肪酸（SCFA）是肠道中最丰富的微生物代谢物，通过激活G蛋白偶联受体（如Gpr41和Gpr43）在宿主免疫调节中发挥重要作用。靶向代谢组学分析表明，与正常小鼠相比，淫羊藿次苷I明显提高了小鼠粪便中包括乙酸、丙酸、丁酸和戊酸在内的短链脂肪酸的丰度以及总短链脂肪酸的含量，而在荷瘤小鼠的肿瘤生长中SCFA显著下调（图4A和B）。Spearman相关分析表明SCFA与乳杆菌和双歧杆菌呈正相关（图4C-E），之前有报道称它们会在小鼠粪便中产生SCFA。淫羊藿次苷I给药显著提高了结肠中Gpr41和Gpr43的mRNA水平，进一步支持了肠道细菌发酵产生的SCFA显著升高（图4F和G）。

图4 淫羊藿次苷I改善肠道短链脂肪酸代谢。（A）每组粪便样本中短链脂肪酸（醋酸盐、丙酸盐、丁酸盐和戊酸盐）的靶向定量。（B）粪便中短链脂肪酸的总浓度。（C）基于肠道微生物群和粪便中微生物群来源的SCFA之间的Spearman相关分析的相关热图。（D-E）乳杆菌或双歧杆菌的相对丰度与总SCFA之间的Spearman相关性分析。（F-G）Gpr41和Gpr43的结肠mRNA。值表示为平均值±标准差（n = 6-8）。

5. 淫羊藿次苷I改善微生物群衍生的吲哚代谢

对参与色氨酸代谢的微生物群衍生的吲哚代谢物的靶向分析表明，肿瘤生长明显损害了吲哚代谢途径（图5A-D），在荷瘤小鼠结肠和粪便中主要表现为显著下调吲哚代谢物，包括吲哚乙酸（IAA）、吲哚丙烯酸（IA）和吲哚，它们通常被认为是内源性AhR配体。淫羊藿次苷I给药显著改善了荷瘤小鼠结肠和粪便中这些吲哚代谢物的水平（图5A-D），并伴随着血浆中吲哚代谢物丰度的恢复。同时，在淫羊藿次苷I治疗后，荷瘤小鼠结肠中AhR的mRNA水平恢复（图5E），结肠中IL-22的mRNA水平也恢复，据报道IL-22的水平变化和肠道稳态相关。进一步的Spearman等级相关分析表明，乳杆菌和双歧杆菌与小鼠粪便中的多种微生物来源的吲哚代谢物和 AhR 激动剂呈正相关（图5F和G）。相反，荷瘤小鼠的肿瘤重量与粪便、结肠和血浆微生物群衍生的AhR配体呈负相关。

图5 淫羊藿次苷I改善微生物群衍生的吲哚代谢。（A、C）每组粪便和结肠组织中微生物群衍生的吲哚代谢物（ILA、IA、IPA、吲哚、IAA、IAId和色胺）的定量。（B、D）粪便和结肠样品中AHR激动剂（ILA、IA、吲哚、IAA和IAId）的总浓度。（E）AhR的结肠mRNA。（F-G）粪便AhR激动剂与乳杆菌或双歧杆菌相对丰度的Spearman相关性。值表示为平均值±标准差（n = 6-8）。

6. 淫羊藿次苷I改善肠道通透性、全身炎症和免疫性

结肠的过碘酸 -希夫（PAS）染色表明，荷瘤小鼠产生粘蛋白的杯状细胞数量低于正常小鼠（图6A和B）。因此，肿瘤的生长改变了肠道通透性，表现为荷瘤小鼠回肠和血浆CD14中Myosin、Ptprh等肠道通透性指标的mRNA水平显著上调，导致肠道屏障完整性破坏和肠道渗漏（图6C-E）。荷瘤小鼠的还表现出在血浆中高水平的细菌内毒素LPS和在血浆和肿瘤组织中高水平的促炎细胞因子，包括IL-6和IL-1β（图6F-J），表明肿瘤生长诱导了全身炎症。淫羊藿次苷I治疗显著增加了杯状细胞的数量，改善了荷瘤小鼠的肠道通透性和全身炎症，相应的标志物包括回肠肌球蛋白、Ptprh、血浆CD14和LPS以及促炎细胞因子均有显著改善（图6B-J)。

鉴于肠道微生物群和衍生代谢物与宿主免疫之间的密切关系，我们接下来分析了淫羊藿次苷I对全身免疫的影响，包括通过流式细胞术检测多淋巴细胞。结果表明，淫羊藿次苷I处理显著提高了荷瘤小鼠外周血中CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的百分比，其CD4+ T细胞和CD8+ T细胞水平低于正常小鼠（图7B、E和F）。此外，流式细胞术分析表明，淫羊藿次苷I治疗还提高了荷瘤小鼠外周血中自然杀伤细胞(NK)和自然杀伤T细胞(NKT)的百分比（图7A、C和D），表明淫羊藿次苷I通过调节循环系统中的多个淋巴细胞亚群，具有显著的免疫抗肿瘤活性。此外，淫羊藿次苷I给药后小鼠肿瘤组织中淋巴细胞，尤其是肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)和CD8+ T细胞的比例显著上调。

图6 淫羊藿次苷I改善肠道通透性和全身炎症。（A）每组结肠的代表性高碘酸-希夫(PAS)染色图像(200X，比例尺=100 μm)。()（B）结肠杯状细胞的数量。（C-E）肠道通透性标志物，包括回肠中肌球蛋白和Ptprh的mRNA水平以及血浆中可溶性CD14的浓度。（F-H）全身炎症标志物，包括血浆中LPS、IL-6和IL-1β的浓度。（I和J）肿瘤组织中IL-6和IL-1β蛋白水平的ELISA分析。值表示为平均值±标准差(n=4-6)。

图7 淫羊藿次苷I提高荷瘤小鼠外周血中多个淋巴细胞的比例。（A）NK细胞(CD3^-CD49b⁺)和NKT细胞(CD3⁺CD49b⁺)的代表性流式细胞分析图像。（B）CD4+ T细胞(CD3⁺CD4⁺)和CD8+T细胞(CD3⁺CD8⁺)的代表性流式细胞分析图像。NK（C）、NKT（D）细胞和CD4+（E）、CD8+（F）T细胞的相应定量。值表示为平均值±标准差（n= 5）。

7. 相关性分析揭示了淫羊藿次苷I在微生物代谢轴中免疫调节作用的关键特征

Spearman相关分析确定了淫羊藿次苷I治疗后荷瘤小鼠的免疫改善相关的微生物群及其衍生代谢物。具体而言，乳杆菌属和双歧杆菌属与包括CD4+ T细胞、CD8+ T细胞和NK细胞在内的多个淋巴细胞亚群呈正相关，与促炎细胞因子如IL-6和IL-1β呈负相关。CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的数量也与Turicibacter和Adlercreutzia属的丰度呈正相关，但与Ruminococcus和Bacteroides属呈负相关（图8A）。此外，淋巴细胞亚群和促炎细胞因子也与大多数微生物群衍生的代谢物高度相关，尤其是乙酸盐、丙酸盐、丁酸盐、吲哚丙烯酸（IA）和吲哚乙酸（IAA）（图8B）。发现总SCFAs和微生物群衍生的AhR激动剂分别与CD4+/CD8+ T细胞和NK细胞呈正相关（图8C-E）。

图8 淋巴细胞亚群、促炎细胞因子和（A）肠道细菌和（B）其衍生代谢物之间的Spearman相关性分析。（C和D）外周血CD4+T细胞或CD8+ T细胞比例与小鼠粪便中总SCFAs的Spearman相关分析。（E）外周血NK细胞比例与粪便AhR激动剂之间的Spearman相关分析。正相关显示为红色，而负相关标记为蓝色。

讨论

淫羊藿在中国、日本和韩国等许多亚洲国家被广泛用作传统草药配方。从淫羊藿中分离得到的主要生物活性化合物包括淫羊藿苷、淫羊藿素、淫羊藿次苷Ⅰ和淫羊藿次苷Ⅱ，它们的分子结构相似。最近，大量研究集中在淫羊藿苷、淫羊藿素和淫羊藿次苷II三种化合物在多种癌症中的抗癌活性方面，如肝癌、前列腺癌和多发性骨髓瘤等。在这项研究中，首次结合16S rRNA基因测序、靶向代谢组学和生物测定，研究了肠道微生物群在B16F10黑色素瘤模型中淫羊藿次苷I免疫抗肿瘤活性的潜在机制和作用。

新出现的证据表明，肠道微生物群通过调节宿主免疫系统在癌症免疫治疗中发挥重要作用。在这里，淫羊藿次苷I治疗显著改善了肿瘤异种移植物诱导的微生物群多样性和组成，包括门水平的厚壁菌门、放线菌门和拟杆菌门。特别值得注意的是，口服淫羊藿次苷I显著增加了荷瘤小鼠的盲肠内双歧杆菌和乳杆菌的丰度，这两种共生菌由于调节免疫系统而被认为对人类健康有益。因此，在淫羊藿次苷I治疗后，肠道通透性、肠道屏障完整性、内毒素LPS和肿瘤生长诱导的炎症也得到改善。同时观察到淫羊藿次苷I通过降低的肿瘤重量和体积以及改善组织病理学来对肿瘤生长进行显著抑制。与我们的研究结果一致，之前的研究发现，单独口服双歧杆菌可有效降低肿瘤生长，达到与PD-L1抗体免疫疗法相同的程度。口服乳杆菌可以通过促进抗肿瘤免疫和增强多个淋巴细胞亚群的活性来抑制肿瘤生长。先前的研究还表明，双歧杆菌和乳杆菌均具有维持结肠粘液层完整性和肠道通透性的能力。

除了肠道菌群本身，其衍生代谢物如SCFAs和吲哚衍生物也被证明通过代谢信号通路具有免疫调节功能。我们的结果表明，在淫羊藿次苷I治疗后，荷瘤小鼠肠道中SCFAs和吲哚衍生物的水平显著恢复。许多研究表明，SCFAs尤其是丁酸盐能够通过代谢信号调节肠粘膜免受炎症、改善宿主免疫反应和减少结肠癌细胞的肝转移。在本实验中，SCFAs的显著升高伴随结肠Gpr41和Gpr43 mRNA的上调表明淫羊藿次苷I激活了肠道细菌发酵过程。先前的研究还表明，微生物群衍生的SCFAs可以增强抗原激活的CD8+ T细胞的细胞代谢和记忆潜力，以及促进CD4+ T细胞的活性和分化。大多数微生物群衍生的吲哚衍生物是AhR的内源性配体，其参与宿主免疫代谢、肥胖和癌症等代谢疾病的多种病理生理过程。先前在人类和动物模型的肥胖、糖尿病和高血压(BHP)等代谢综合征中观察到AhR水平显著下调，肠道微生物群衍生的AhR激动剂（如吲哚衍生物）水平较低。此外，据报道，色氨酸衍生物（例如6-甲酰基吲哚并[3,2-b]咔唑）激活AhR可增强NK细胞对肿瘤生长的控制，并维持小鼠肝脏中的NK细胞。在这项研究中，淫羊藿次苷I显著上调了荷瘤小鼠粪便和结肠样本中吲哚衍生物的水平。同时，在淫羊藿次苷I治疗后，结肠的AhR mRNA水平表达也以剂量依赖性方式得到改善。有趣的是，我们的结果还揭示了微生物群衍生的SCFA和吲哚衍生物以及乳杆菌和双歧杆菌之间存在显著的正相关。大量研究表明，微生物群衍生的SCFA和吲哚衍生物可以从益生菌如乳酸菌和双歧杆菌中产生。

淫羊藿次苷I治疗后，荷瘤小鼠外周血中包括CD4+ T、CD8+ T、NK和NKT细胞在内的多种淋巴细胞显著升高，进一步直接支持了淫羊藿次苷I的免疫抗肿瘤活性，表明淫羊藿次苷I增强了宿主免疫功能。众所周知，包括CD4+ T和CD8+ T细胞在内的适应性T细胞可以介导抗肿瘤免疫治疗的细胞毒性反应。具体而言，CD8+T细胞目前被认为是最有效的破坏肿瘤的元素，它可以被表达肿瘤细胞的表面分子激活，导致肿瘤细胞凋亡。CD8+ T细胞数量较多的黑色素瘤患者更有可能在免疫治疗方面获得更好的结果，因此通常被视为肿瘤细胞裂解的免疫治疗靶点。NK和NKT细胞能够通过分泌多种细胞因子和趋化因子（如IFN-γ和CC-趋化因子配体3（CCL3））并激活肿瘤细胞的半胱天冬酶，在无需事先致敏的情况下识别并自发杀死肿瘤细胞。近年来，CD4+ T细胞因其在直接或间接调节抗肿瘤免疫方面的功能多样性而受到越来越多的关注，例如促进CD8+ T细胞的活化和分化，增强杀伤肿瘤细胞的活性。

结论

总之，这项研究表明，淫羊藿次苷作为一种从淫羊藿中分离出来的新型化合物，通过调节肠道微生物群及其衍生代谢物显著改善宿主肠道屏障和免疫力。具体来说，淫羊藿次苷I治疗显著上调益生菌的水平，如乳杆菌和双歧杆菌及其代谢产物，包括SCFA和吲哚衍生物，它们通过结肠Gpr41/Gpr43和AhR信号参与宿主代谢调节。这些发现表明，淫羊藿次苷I具有低毒性和免疫抗肿瘤活性，可有效提高宿主免疫力并抑制肿瘤生长。专注于淫羊藿次苷I的肿瘤免疫调节治疗的临床研究确实是有必要的，并且应该对如何将这种化合物开发为癌症的新型治疗剂有所了解。