快报 | 贝达喹啉对巨噬细胞耐多药结核分枝杆菌感染模型作用的观察

作者：吕霞丽，林婷婷，高静韬，贾红彦，朱传智，李自慧，董静，孙琦，舒薇，王赛赛，潘丽萍，黄海荣，张宗德，李琦

第一作者：吕霞丽 ，单位：北京市结核病胸部肿瘤研究所 首都医科大学附属北京胸科医院 耐药结核病研究北京市重点实验室

通信作者：李琦，单位：北京市结核病胸部肿瘤研究所 首都医科大学附属北京胸科医院 耐药结核病研究北京市重点实验室

Effects of Bedaquiline on Antimicrobial Activity and Cytokine Secretion of Macrophages Infected with Multidrug-Resistant Mycobacterium tuberculosis Strains

Lyu XL，Lin TT，Gao JT，Jia HY，Zhu CZ，Li ZH，Dong J，Sun Q，Shu W，Wang SS，Pan LP，Huang HR，Zhang ZD，Li Q.

Can J Infect Dis Med Microbiol，2022 ，2022: 2703635. 

doi: 10.1155/2022/2703635. 

PMID: 35449601 

背景

肺结核是一种慢性传染性疾病。其中，耐多药结核病（multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB）和利福平耐药结核病（rifampicin-resistant tuberculosis，RR-TB）的治疗则较为困难，其治疗成功率较低。据2020年世界卫生组织（World Health Organization，WHO）报道：全球MDR/RR-TB患者的治疗成功率约为57%，我国MDR/RR-TB患者的治疗成功率仅为52%。因此，抗结核新药的研发是结核病控制、特别是耐药结核病控制的重要策略。在药物研发中，利用生物学方法模拟宿主与病原菌间的相互作用将有助于了解耐多药结核分枝杆菌的耐药机制、抗结核新药的疗效及其机制，以便为MDR-TB的控制提供更好的治疗方案。 贝达喹啉（Bdq）是一种二芳基喹啉类化合物，通过特异性抑制结核分枝杆菌的ATP合成酶而发挥杀菌作用，对结核分枝杆菌敏感株和耐药株均有较强的杀菌活性。据2020年WHO结核病报告，含Bdq的化疗方案已进入III期临床试验，有关Bdq的临床疗效已有报道，含Bdq的化疗方案治疗MDR-TB也具有较高的疗效，但有关Bdq对巨噬细胞耐多药结核分枝杆菌感染模型（简称MDR-MTB感染模型）的作用及其机制等少有报道。因此，本研究观察Bdq对巨噬细胞MDR-MTB感染模型的杀菌作用；基于细胞因子参与巨噬细胞活化、吞噬、杀菌等功能，我们选择既往报道较少的4个Th1/Th2（辅助性T细胞1/辅助性T细胞2）相关细胞因子，观察其在Bdq作用于巨噬细胞MDR-MTB感染模型后的变化，探讨可能的细胞免疫机制，为进一步完善Bdq的作用机制提供依据。

研究方法

1. 感染细胞实验：将结核分枝杆菌接种到7H9培养基（含10% OADC和0.05%吐温-80）中，37℃培养至对数生长期（吸光度值600 ≈ 0.6~1.0）。THP-1细胞在RPMI-1640培养基（含10%胎牛血清）中培养至合适密度，加入100ng/ml佛波酯36~48 h使其诱导分化为巨噬细胞，采用超声分散仪将结核分枝杆菌进行分散和计数，按照感染复数（MOI）=10：1对细胞进行感染。37℃，5% CO2培养箱中孵育，计算感染时间。

2. 最低抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC）测定：采用微孔培养显色法（MABA）测定MIC，即7H9培养基重悬结核分枝杆菌（菌悬液浓度约为1×106 CFU/ml）。96孔板两侧加入200 μl生理盐水。第2孔加入200 μl含10%OADC（oleic acid-albumin-dextrose-catalase，油酸-白蛋白-右旋葡萄糖-过氧化氢酶）的7H9培养基稀释后的Bdq（2 μg/ml），3~11孔加入100 μl含10%OADC的7H9培养基，按照倍比稀释加入Bdq。实验重复3次。37℃培养箱内孵育7 d，每孔加入32.5 μl染色剂（20 μl Alamar-Blue和12.5μl的20% Tween-80），37℃培养箱孵育24 h。以蓝色孔为无菌生长，粉色孔为有菌生长，液体由蓝色变为粉色表明有细菌生长。MIC被定义为防止颜色从蓝色变为粉色的最低药物浓度。

3. 巨噬细胞胞内结核分枝杆菌的CFU计数（colony-forming unit Assay）：向诱导分化的巨噬细胞中加入结核分枝杆菌感染4h，弃上清后PBS（phosphate buffered saline，磷酸盐缓冲液）洗涤3~4次，之后分别加入药物浓度为MIC、10MIC和20MIC的Bdq作用4h、8h、24h和48h。吸弃上清后每孔加入1ml含0.5%Triton X -100的PBS裂解液，吹打20~30次混匀。吸取100μl至含900μl PBS的1.5ml离心管中，依次做4个浓度梯度，即得细胞裂解液的10-1、10-2、10-3、10-1稀释。取50μl细胞裂解稀释液接种于7H10培养基上，涂匀倒扣于37℃培养箱孵育3-4周，计数菌落。实验各重复3次。

4. 液相芯片多因子检测Magnetic Luminex® Assay：向诱导分化的巨噬细胞中加入结核分枝杆菌感染4h，弃上清后PBS洗涤3~4次，之后分别加入药物浓度为MIC的Bdq作用4h、24h和48h。无菌注射器吸去细胞上清，经0.22μm针头过滤器除菌，分装到无菌EP管中冻存备用。按照试剂盒说明书配制稀释标准品、磁珠、生物素标记的抗体和Streptavidin-PE Concentrate等，将稀释好的标准品和待测样品加入到96孔板中，进行孵育、洗板等。Luminex® 200TM上机检测细胞因子白介素-12/23 p40（interleukin-12/23 p40，IL-12/23 p40）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素-6（interleukin-6，IL-6）和白介素-10（interleukin-10，IL-10）的变化。实验各重复3次。

研究结果

一、Bdq细胞毒性实验

Bdq对巨噬细胞增殖-毒性试验见表1，从表中可见随着作用时间的延长，空白孔、对照孔和实验孔的OD450值呈现增高的趋势。在同一时间点，随着作用浓度的增加，实验孔的OD450值呈现降低的趋势。在不同的浓度和时间下，Bdq对巨噬细胞的存活率为100%，抑制率为0%。

二、Bdq作用于MDR-MTB感染模型后的胞内CFU计数结果

Bdq作用于H37Rv和MDR-MTB感染模型后胞内CFU计数结果见表2。从表中可见：①Bdq以MIC剂量给药后4~48h，H37Rv和MDR-MTB组胞内CFU计数分别较给药前、较感染组（未给药组）逐渐下降，给药后48h达最低值（P<0.05）。②增加给药剂量至10MIC和20MIC后8~48h，H37Rv和MDR-MTB组胞内CFU计数较MIC剂量给药时进一步降低（P<0.05）。此外，H37Rv组10MIC和20MIC给药后各时间点的胞内CFU计数相接近（P>0.05）。而MDR-MTB组以20MIC给药后各时间点胞内CFU计数均低于10MIC给药（P<0.05）。

Bdq以MIC剂量给药后对H37Rv和MDR-MTB感染模型胞内CFU计数比较结果见图1。从图中可见：给药后4~24h，MDR-MTB组胞内CFU计数高于H37Rv组（P<0.05）；而给药后48h，两组胞内CFU计数则相接近（P>0.05）。

图1 Bdq以MIC剂量给药后对H37Rv和MDR-MTB感染模型胞内CFU计数比较结果

三、Bdq作用于MDR-MTB感染模型后4个Th1/Th2因子测定结果

1. Th1因子（IL-12/23 p40和TNF-α）表达量测定结果

（1）IL-12/23 p40表达量测定结果：Bdq以MIC剂量给药后，H37Rv和MDR-MTB感染模型培养上清IL-12/23 p40表达量测定结果见表3。从表中可见：两组给药后各时间点IL-12/23 p40表达量较给药前均无明显变化，且两组IL-12/23 p40表达量相接近（P>0.05）。此外，H37Rv组给药后48h的IL-12/23 p40表达量低于感染组（P<0.05）；MDR-MTB组给药后4h的IL-12/23 p40表达量高于感染组（P<0.05）。

（2）TNF-α表达量测定结果：Bdq以MIC剂量给药后，H37Rv和MDR-MTB感染模型培养上清TNF-α表达量测定结果见表4。从表中可见：两组给药后24h、48h的TNF-α表达量均较给药前增高（P<0.05），且两组TNF-α表达量相接近（P>0.05）。此外，仅MDR-MTB组给药后24h的TNF-α表达量高于感染组（P<0.05）。

2. Th2因子（IL-6和IL-10）表达量测定结果

（1）IL-6表达量测定结果：Bdq以MIC剂量给药后，H37Rv和MDR-MTB感染模型培养上清IL-6表达量测定结果见表5。从表中可见：两组给药后24h、48h的IL-6表达量较给药前增高，且MDR-MTB组给药后24h、48h的IL-6表达量高于H37Rv组（P<0.05）。此外，H37Rv组给药后24h、48h的IL-6表达量均低于感染组（P<0.05）。MDR-MTB组IL-6表达量在给药后24h高于感染组（P<0.05）。

  （2）IL-10表达量测定结果：Bdq以MIC剂量给药后，H37Rv和MDR-MTB感染模型培养上清IL-10表达量测定结果见表6。从表中可见：两组给药后各时间点IL-10表达量均无明显变化，且两组IL-10表达量相接近（P>0.05）。此外，H37Rv组给药后48h的IL-10表达量低于感染组（P<0.05）；而MDR-MTB组给药后24h、48h的IL-10表达量均低于感染组（P<0.05）。

3. Bdq介导Th1/Th2因子变化与MDR-MTB感染模型胞内CFU计数关系的分析

药物浓度为MIC的Bdq介导Th1因子IL-12/23 p40、TNF-α和Th2因子IL-6、IL-10变化与MDR-MTB感染模型胞内CFU计数关系的分析结果见图2。从图中可见：Bdq作用后各时间点IL-12/23 p40和IL-10表达量相接近，不随胞内CFU计数的变化而变化，但IL-12/23 p40表达量在给药后4h高于感染组，IL-10表达量则在给药后24h、48h低于感染组。此外，TNF-α表达量在给药后24h、48h随着胞内CFU计数降低而增高，且其表达量在给药后24h高于感染组（P<0.05）。IL-6表达量随着胞内CFU计数降低逐渐升高，但均与感染组相接近。

图2 药物浓度为MIC的Bdq介导Th1因子IL-12/23 p40、TNF-α和Th2因子IL-6、IL-10变化与MDR-MTB感染模型胞内CFU计数关系的分析结果

研究意义与展望

本研究首先建立巨噬细胞耐多药结核分枝杆菌感染模型，观察贝达喹啉（Bdq）对感染模型的杀菌作用，并探讨与其杀菌作用可能相关细胞因子的分泌和表达，为进一步完善Bdq的作用机制提供依据。实验结果表明：Bdq对胞内耐多药结核分枝杆菌具有较强的杀菌作用，且具有时间和浓度依赖性。对胞内耐多药结核分枝杆菌与H37Rv的后期杀菌活性相接近。Bdq可能具有免疫调节作用，在给药后不同时间点诱导Th1因子IL-12/23p40和TNF-α的高表达、Th2因子IL-10的低表达。

既往研究表明，耐多药结核分枝杆菌感染可导致宿主体内细胞免疫功能异常，从而导致耐多药结核分枝杆菌的杀灭、清除受限。本实验中我们使用耐多药结核分枝杆菌（临床编号：24635）感染巨噬细胞后，观察其杀菌作用与细胞因子的分泌和表达，之后观察Bdq对MDR-MTB感染模型的杀菌作用及细胞因子的影响，最后探讨杀菌作用与细胞因子的关系。然而还有一些问题亟待解决：动物水平是评价药物疗效及作用机制的关键一环，接下来会在动物水平探讨药物的杀菌作用与相关细胞因子表达和分泌的关系。未来应在动物模型上，扩大耐多药结核分枝杆菌的样本量和耐药类型，进一步研究，以获得更为可靠的研究结果。

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编辑：王    然

审校：郭    萌

发布日期：2022-05-23