快报 | Hsa_circ_0001204通过TLR4/NF-κB信号通路调节结核分枝杆菌感染巨噬细胞的炎症反应

作者：马晓卿，王方，甄利波，蔡青山

第一作者及单位：马晓卿，浙江大学医学院附属杭州市胸科医院/浙江省中西医结合医院/杭州市红十字会医院

通信作者及单位：蔡青山，浙江大学医学院附属杭州市胸科医院/浙江省中西医结合医院/杭州市红十字会医院

Hsa_circ_0001204 modulates inflammatory response of macrophages infected by Mycobacterium tuberculosis via TLR4/NF-κB signaling pathway

Xiaoqing Ma, Fang Wang, Libo Zhen, Qingshan Cai.

Clin Exp Pharmacol Physiol，2022 Sep 1.

doi: 10.1111/1440-1681.13716.

PMID: 36048566.

研究背景

结核病（TB）是一种致命的传染性疾病，主要由结核分枝杆菌（MTB）引起。巨噬细胞是MTB感染和持留的主要靶细胞，它可以通过炎症反应和免疫防御机制抑制MTB的生长和复制。探讨巨噬细胞与MTB之间的相互作用，对寻找有效的结核病治疗策略至关重要。

环状RNA（circRNA）广泛参与各种生物过程，如增殖、细胞凋亡和炎症。一些circRNA已被确定为结核病的诊断生物标志物，参与巨噬细胞对MTB感染的调节。Hsa_circ_0001204是一个新的circRNA，来源于DGCR8基因座，该基因座位于染色体22：20070853-20070981，长度为128个核苷酸。Hsa_circ_0001204在活动性肺结核患者的血清中表达明显不足，其表达水平与疾病严重程度呈负相关，被认为是快速诊断肺结核的潜在非侵入性分子标志物。然而，关于它在结核病中的参与机制，还存在很大的知识空白。circRNA可以通过调节信号级联在许多疾病中发挥重要作用。TLR4/NF-κB是结核病中一个重要的炎症信号通路。我们旨在通过体外细胞实验探索hsa_circ_0001204对MTB感染诱发的巨噬细胞凋亡和炎症反应的影响。同时研究了TLR4/NF-κB信号通路与hsa_circ_0001204在结核病中的潜在调节关系。

研究方法

一、研究对象 

2018年1月至2019年1月，从浙江大学医学院附属杭州市胸科医院共招募20例诊断为活动性肺结核的患者和20名健康受试者。结核病患者在接受抗结核治疗前和健康志愿者均抽取5 ml的外周血。血液样本在室温下放置在促凝管中30 min，然后在400×g离心10 min。上层血清样本保存在-80 ℃以备后期进一步分析。研究获得患者知情同意及杭州红十字会医院机构伦理委员会批准[批准号：2021（224）]。

二、研究方法

1.细胞培养和处理：人巨噬细胞THP-1细胞购自中国科学院细胞库（中国上海）。细胞在加入10%胎牛血清（FBS）的RPMI-1640培养基（Gibco, Carlsbad, CA, USA）中，37 ℃和5%CO2下培养。随后，用H37Rv（ATCC, Manassas, VA, USA）感染细胞，感染倍数（MOI）为0、1、5或10，培养时间为0、12、24和48 h。

2.RNA酶 R消化和亚细胞定位：将从THP-1细胞内提取的2 μg RNA样品与6 U的RNA酶 R 孵育，然后用qRT-PCR分析来确定线性DGCR8 mRNA和hsa_circ_0001204的水平。对于亚细胞组分的检测，则根据PARIS试剂盒（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）说明书，从THP-1细胞中提取核和胞质组分，再通过qRT-PCR测定hsa_circ_0001204、U6（核转录物内参）和GAPDH（细胞质转录物内参）的水平。

3.细胞转染：为了构建hsa_circ_0001204过表达的重组慢病毒载体，由GenePharma（中国上海）合成人的hsa_circ_0001204 cDNA并克隆到pLC5-ciR质粒（Geneseed Biotech，广州，中国）中。以空载体作为对照。使用Lipofectamine 3000（Invitrogen）处理48 h将质粒转染到293T细胞中包装慢病毒载体。然后，用慢病毒载体感染THP-1细胞（5×105 cells/ml），并加入聚凝胺（6 μg/ml）以促进感染。在37 ℃下感染24 h后，富集细胞并在新鲜的全培养基中培养72 h。用嘌呤霉素（5 μg/ml）选择转染成功的THP-1细胞，并通过qRT-PCR确认转染效率。用MTB感染转染成功的THP-1细胞24 h，MOI为5。

4.qRT-PCR分析：使用Trizol（Life Technologies, Carlsbad, CA, USA）从收集的样品中提取总RNA，并使用TaqMan反转录试剂（Invitrogen）反转录成cDNA。根据qPCR试剂盒说明书建立PCR反应体系（包括2 μl cDNA、10 μl SYBR Green Mix和引物）。qPCR扩增反应在95 ℃下开始5 min，然后95 ℃ 30 s，60 ℃ 40 s，72 ℃ 30 s，循环38次，以GAPDH作为内参。用2-∆∆Ct法评估表达量。

5.菌落形成单位（CFU）测定：收集细胞，用0.5%的TritonX-100裂解20 min，10倍梯度稀释，并接种到Middlebrook 7H11琼脂平板。在37 ℃下培养3周后，可见菌落后计数CFU。

6.CCK-8检测：培养的细胞以2000个细胞/孔的密度重新转种。24 h后在每个孔中加入10 μl CCK-8（碧云天生物技术，上海）。反应2 h后，使用微孔板分光光度计（Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA）在450 nm波长下检测吸光度。

7.流式细胞仪检测：使用Annexin V FITC/PI凋亡检测试剂盒（BD Biosciences, San Jose, CA, USA）通过流式细胞仪检测细胞凋亡。收集细胞并用冰PBS缓冲液清洗，在暗室中双染15 min后，进行流式细胞检测。

8.蛋白质印迹分析：将细胞溶解在RIPA缓冲液（碧云天生物技术，上海）中提取总蛋白。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离30 μg总蛋白，并将其电转印到PVDF膜上，随后用1:1000稀释度的一抗（均来自Cell Signaling Technology, Boston, MA, USA）封闭过夜。Bcl-2（#3498）、Bax（#5023）、裂解的caspase-3（#9661）、TLR4（#38519）、p-p65（#3033）、p65（#8242）、p-IκBα（#2859）、IκBα（#4812）或GAPDH（#5174）和抗兔血清IgG、HRP标记的二抗（#7074；1:2000稀释）进行2 h的封闭。加入SignalFire™ Elite ECL试剂（#12757; Cell Signaling Technology）进行发光信号检测。

9.酶联免疫吸附试验（ELISA）：使用商品化ELISA试剂盒（碧云天生物技术，上海）对收集的细胞上清液中的IL-6、IL-1β和TNF-α水平进行检测。

10.免疫荧光检测：细胞用4%多聚甲醛固定30 min，用0.3% Triton X 100处理20 min。在室温下用5%的山羊血清封闭30 min后，用p-p65抗体（1:1600稀释度；#3033；Cell Signaling Technology）在4 ℃下孵育过夜，用IgG抗体（1:500稀释度；#8889；Cell Signaling Technology）在室温下孵育1 h。细胞核在室温下用DAPI染色30 min。使用荧光显微镜（Olympus公司，东京，日本）捕捉荧光图像。

三、统计学处理 

正态分布的计量资料以“平均值±标准差”描述，组间差异的比较采用student’s t 检验或单因素方差分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。

研究结果

一、结核病患者和MTB感染的THP-1细胞中Hsa_circ_0001204表达下调

与健康对照组相比，Hsa_circ_0001204在结核病患者中的水平明显下降（图1A）。同样，在MTB感染的THP-1巨噬细胞中，hsa_circ_0001204的水平也随剂量和时间的变化而下调（图1B、1C）。为了确认hsa_circ_0001204的环状结构，进行了RNA酶 R消化试验，结果显示：与其线性形式DGCR8相比，环状的hsa_circ_0001204对RNA酶 R具有抗性（图1D）。通过核细胞质分离法对hsa_circ_0001204进行亚细胞定位，数据表明，hsa_circ_0001204主要定位在THP-1细胞的细胞质部分（图1E）。

注  A：通过qRT-PCR技术测量肺结核患者（20例）和健康对照组（20名）血清中hsa_circ_0001204的相对表达水平。B：通过RT-qPCR检测hsa_circ_0001204在人THP-1巨噬细胞中不同MOI感染下的表达；数据来自3次独立实验。C：通过qRT-PCR检测hsa_circ_0001204在感染MTB（MOI=5）的THP-1细胞中不同时间点的表达；数据来自3次独立实验。D：分析了hsa_circ_0001204对RNA酶R的抗性，并以其线性形式DGCR8作为对照；数据来自3次独立的实验。E：分析了hsa_circ_0001204在THP-1细胞中的亚细胞分布，以U6和GAPDH作为细胞核标记和细胞质标记；数据来自3次独立实验。数据以平均值±标准差（SD）表示。*为P<0.05，**为P<0.01

图1  Hsa_circ_0001204在结核病患者和MTB感染的THP-1细胞中下调 

二、hsa_circ_0001204的过表达抑制了MTB诱导的THP-1细胞的凋亡

通过过表达载体的转染，成功实现了hsa_circ_0001204的过表达（图2A）。此外，H37Rv感染THP-1细胞后，细胞内MTB的CFU计数增加，而hsa_circ_0001204的过表达减少了MTB的细胞内生长（图2B）。在THP-1细胞存活方面，CCK-8检测和流式细胞仪以及Western blotting分析表明，MTB感染降低了细胞增殖并诱导细胞凋亡，同时伴随着裂解caspase-3和Bax的上调以及Bcl-2水平的降低；然而，hsa_circ_0001204水平的过表达导致了相反的效果（图2C、2D、2E）。

注  A：实时PCR检测转染了hsa_circ_0001204过表达质粒或其空载体的THP-1细胞中hsa_circ_0001204的表达水平。转染48 h后，细胞被MTB感染（MOI=5）24 h；B：CFU检测确定MTB的存活率；C：CCK-8试验检测细胞存活率；D：用FACS记录细胞凋亡率；E：Western blot检测Bcl-2、Bax和裂解的caspase-3水平，并与GAPDH进行标准化。数据来自3次独立的实验，以“平均值±标准差”表示。**：P<0.01；##：P<0.01 

图2 过度表达hsa_circ_0001204可抑制MTB诱导的THP-1细胞的凋亡

三、hsa_circ_0001204的过表达阻碍了MTB诱导的THP-1细胞炎症反应

MTB感染后，促炎症细胞因子IL-6、IL-1β和TNF-α的mRNA水平有所提高，而hsa_circ_0001204的过表达则抑制了这一现象（图3A）。此外，ELISA检测显示，MTB感染也促进了IL-6、IL-1β和TNF-α的分泌，而hsa_circ_0001204的强化表达抑制了这些细胞因子的产生（图3B）。

注  A：hsa_circ_0001204过表达的THP-1细胞对MTB感染中，IL-6、IL-1β和TNF-α的mRNA水平。B：ELISA检测细胞培养上清液中的IL-6、IL-10和TNF-α水平。数据来自三次独立的实验，以“平均值±标准差”表示。**：P<0.01；##：P<0.01

图3  hsa_circ_0001204的过量表达阻碍了MTB诱导的THP-1细胞的炎症反应

四、Hsa_circ_0001204负向调控TLR4/NFκB信号通路

我们进一步确定hsa_circ_0001204是否通过调节TLR4/NFκB信号通路来发挥其保护作用。如图4A所示，在MTB感染的细胞中，TLR4蛋白水平以及p65和IκBα的磷酸化明显增强，但hsa_circ_0001204的上调使其逆转。此外，通过免疫荧光显微镜检测，hsa_circ_0001204过表达后，MTB感染的细胞核p65表达明显减少（图4B）。

注  A：在hsa_circ_0001204过表达的THP-1细胞中测定TLR4蛋白水平以及p65和IκBα的磷酸化，以应对MTB感染。B：通过免疫荧光染色评估NF-κB p p65的表达。数据来自3次独立的实验，以“平均值±标准差”或代表图像表示。**：P<0.01；##：P<0.01

图4  Hsa_circ_0001204对MTB感染的THP-1细胞中的TLR4/NF κB信号通路进行负向调节 

研究结论

hsa_circ_0001204能抑制细胞内MTB的生长，同时改善MTB感染的巨噬细胞的凋亡和炎症，其机制可能是通过抑制TLR4/NF-κB信号通路起到保护作用。本研究提示hsa_circ_0001204有作为结核病预防药物的潜能。

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编辑：孟    莉

审校：范永德

发布日期：2022-10-08