快报 | 不同基因型结核分枝杆菌临床分离株在体外表现出不同的宿主巨噬细胞反应

基金项目：北京市临床重点专科项目（20201214）；北京市教委科研项目（KM202010025001）；北京市结核病胸部肿瘤研究所科研能力提升项目（KJ2021CX010）；首都医学发展科研基金（2020-2-1042）

作者：梁晨1，李潇萌1，李悄1，张旭霞1，任卫聪1，姚丛1，逄宇1，刘毅1，李传友1,2，唐神结1

作者单位：1首都医科大学附属北京胸科医院/北京市结核病胸部肿瘤研究所；2北京市疾病预防控制中心 北京结核病控制研究与防治所

通信作者：刘毅；李传友，唐神结, 

Clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis with different genotypes exhibit distinct host macrophage responses in vitro

Liang C1, Li X1, Li Q1, Zhang X1, Ren W1, Yao C1, Pang Y1, Liu Y1, Li C1,2, Tang S1.

J Med Microbiol，2022，71(11)：001604.

doi:10.1099/jmm.0.001604.

PMID：36748527.

研究背景

结核病是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）感染导致的慢性传染病，仍是严重威胁人类健康的全球公共卫生问题。人类感染MTB后是否发病取决于多种因素，包括菌株毒力、宿主免疫状态等。MTB菌株毒力差异会引发不同的宿主免疫反应。在早期感染阶段，天然免疫细胞内积累和触发宿主巨噬细胞反应的差异是关键的决定因素，形成了宿主对不同MTB菌株的先天免疫反应的差异。在北京地区内流行的MTB主要以Lineage 2（L2）和L4为主，其亚系包括北京、T1、T2、MAUN2、H3和H4等基因型，以典型的北京基因型占比最高（77.28%），是主要的流行菌株基因型。这种不同基因型的分布差异表明各种基因型菌株的传播能力存在一定的差异。L2和L4的MTB被认为传播能力更强、毒力更大，但在两种谱系中还存在不同比例的亚系组成，亚系间不同基因型亦存在着毒力的差异，亚系间毒力差异的研究对深入了解菌株传播规律及相应疫苗的研发至关重要。但目前对各亚系间毒力差异的研究尚少，因此，我们通过比较北京、MANU2和T1基因型菌株感染巨噬细胞后引起的细胞因子分泌、细胞凋亡水平来比较不同基因型MTB的毒力。对北京地区不同基因型MTB的毒力开展研究将更好地理解它们在该地区的流行和传播机制，对于理解病原体如何调节感染过程具有重要意义，而根据感染过程中不同的免疫反应采取针对性措施，这将对结核病的预防和治疗具有积极的意义。

研究方法与结果

1.选取的MTB菌株特征：本研究使用的北京、MANU2、T1基因型菌株和实验室H37Rv标准株是根据Spoligotype分型特征进行选择。3株MTB临床分离株均从无合并症的初治结核病患者体内分离。其中，北京型和MANU2型菌株属于L2，T1基因型属于L4。3株临床分离株的药物敏感性试验结果显示对8种抗结核药物（异烟肼、利福平、乙胺丁醇、氟喹诺酮类、链霉素、阿米卡星、环丝氨酸和对氨基水杨酸）均敏感，无耐药产生。

2.不同基因型MTB的生长曲线：将生长对数期的MTB菌株接种于7H9液体培养基中，调整初始光密度（OD）值为相同，分别在第2、4、6、8、11、14、16、19、23和27天测量各菌株的OD600值。不同基因型MTB的生长曲线如图1。北京型和MANU2型菌株的生长曲线差异无统计学意义。T1型在培养第19天的OD值与北京型和MANU2型菌株的生长差异有均统计学意义（P 值均< 0.05）。

图1 不同基因型MTB的生长曲线

3. RAW264.7细胞感染不同基因型MTB后细胞凋亡水平：H37Rv标准株及北京、T1和 MANU2基因型MTB分别感染RAW264.7细胞24 h时，凋亡率分别为（34.280±0.205）%、（27.460±2.270）%、（33.180±1.018）%、（28.540±1.146）% ，细胞凋亡情况见图2。与H37Rv相比，北京型和MANU2基因型MTB细胞凋亡率均明显降低（P值均＜0.05）；北京型MTB凋亡率低于T1基因型（P＜0.05），但T1与MANU2基因型间差异无统计学意义（P＞0.05）。

图2  RAW264.7细胞感染不同基因型 MTB后细胞凋亡率

4.RAW264.7细胞感染不同基因型MTB后的菌落形成单位（CFU）：为了分析不同基因型MTB感染RAW264.7后在巨噬细胞内的的生存能力，研究在MTB感染细胞24 h时裂解细胞涂板CFU。不同基因型MTB在细胞中存活能力见图3，北京、T1和MANU2基因型MTB的 CFU计数结果分别为（2.470±0.099）×105、（0.910±0.099）×105、（1.090±0.099）×105，北京基因型MTB组的CFU计数多于T1和MANU2基因型MTB组，差异均有统计学意义（P值均＜0.05），但T1与MANU2基因型MTB的存活能力差异无统计学意义（P＞0.05），北京基因型MTB与H37Rv之间的差异也无统计学意义（P＞0.05）。

图3  RAW264.7细胞感染不同基因型MTB后的CFU

5.RAW264.7细胞感染不同基因型MTB后细胞因子及相关受体mRNA的表达：如图4所示，H37Rv、北京、T1和MANU2基因型MTB感染细胞24 h后，IL-1α的mRNA表达量分别为空白对照组的（29.010±1.947）、（6.994±1.127）、（10.710±0.853）和（15.850±1.784）倍；IL-6分别为（96.600±23.10）、（10.390±0.930）、（27.390±4.081）和（39.880±4.702）倍；IL-10分别为（7.405±0.651）、（3.449±0.350）、（5.636±1.061）和（11.790±1.398）倍；TNF-α分别为（2.694±0.061）、（2.578±0.058）、（5.099±0.537）和（4.704±0.242）倍；TLR2基因分别为（6.272±1.248）、（6.464±0.810）、（3.608±0.201）和（4.259±0.788）倍；TLR7基因分别为（4.927± 0.345）、（9.184±0.992）、（6.459±0.517）和（4.063±0.437）倍；NLRP3基因分别为（2.387±0.280）、（3.806±0.336）、（2.942±0.260）、（4.019±0.093）倍；iNOS基因分别为（1.390±0.022）、（3.085±0.270）、（1.731±0.159）和（2.847±0.349）倍。

图4  RAW264.7细胞感染不同基因型MTB后相关细胞因子及免疫受体mRNA的表达

以往研究表明，高毒力菌株会产生比H37Rv更高水平的抗炎性因子与低水平的促炎性因子，而TLR2、TLR7、NLRP3等的高表达更有利于宿主清除MTB，但我们对这些指标的检测结果显示，被认为是高毒力的北京基因型菌株产生的促炎性因子并不全部都呈现低表达，而TLR2、TLR7、NLRP3这3种有利于清除MTB的受体基因的表达同样在北京基因型MTB中呈现高表达，这与高毒力菌株产生抑制免疫反映的结论相矛盾。而产生这种结果的原因可能有：（1）实验选取的细胞系与其他研究存在差异；

（2）基因表达水平随着感染时间的变化而变化；

（3）相同基因型MTB的毒力可能还因地理环境的影响而发生改变；

（4）MTB感染与宿主免疫反应是个复杂反应，细胞因子的分泌等受多种细胞的调控。未来还需要对导致不同基因型MTB毒力差异的分子机制进行更深入的研究。

意义及展望

北京、T1、MANU2基因型MTB在体外均能诱导复杂的细胞因子和受体的表达。北京基因型MTB毒力强于T1和MANU2基因型，且在体外感染实验中，北京基因型MTB存活数也多于T1和MANU2基因型，且能诱导低炎症反应；而T1和MANU2基因型MTB菌株毒力相当，且诱导炎症反应的程度强于北京基因型。对不同基因型MTB毒力的探究对于理解病原体如何调节感染过程具有重要意义，将更有助于对菌株流行和传播机制的了解，而根据感染过程中不同的免疫反应采取针对性的治疗手段，将有助于患者的康复。我们的结果表明有必要利用先进的技术进一步阐明不同菌株间基因组序列和表达的差异，这将有助于鉴定与毒力有关的MTB基因，从而更全面深入地了解毒力的作用机制，为研制新抗结核药物、疫苗的开发提供新的作用靶点而奠定基础。

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供稿：梁    晨

编辑：孟    莉 

审校：范永德

发布日期：2023-03-01