快报 | 环境污染物暴露影响宿主体内结核分枝杆菌内源性激活

作者：陶必林，李忠奇，王钰婷，吴继周，石新玲，时金艳，刘巧，王建明

第一作者及单位：陶必林，南京医科大学公共卫生学院全球健康中心流行病学系/常州市第三人民医院流行病学教研室/南京医科大学姑苏学院流行病学教研室

通信作者及单位：王建明，南京医科大学公共卫生学院全球健康中心流行病学系/常州市第三人民医院流行病学教研室/南京医科大学姑苏学院流行病学教研室；刘巧，江苏省疾病预防控制中心慢性传染病防制所

Environment pollutants exposure affects the endogenous activation of within-host Mycobacterium tuberculosis

Environmental Research，2023，227：115695.

doi：10.1016/j.envres.2023.115695

研究背景

现有空气污染物与结核病发病风险的研究均采用宏观流行病学研究设计，大多数基于时间序列数据进行的生态学研究，并且研究结论尚不一致，对证据判断和决策构成巨大挑战。鉴于目前很多研究结论的异质性，迫切需要更多创新性方法和更高等级的证据来深入剖析空气污染物与宿主体内结核分枝杆菌（MTB）内源性激活的关系。而现有研究报道中尚无基于个体水平的可准确检测的分子流行病学研究。

幸运的是，基因组通常以恒定速率发生突变。例如，传代时间较短的细菌往往具有较高的分子进化速率。因此，单位时间内基因组发生突变的数量可用于计算“分子钟”来估计微生物传代时间（或繁殖速率）。当MTB处于繁殖活动状态时，MTB具有较快的分子钟速率；反之，MTB处于潜伏或休眠等低/无生长繁殖活动状态时，则具有较慢的分子钟速率。宿主感染MTB后，可能的病程进展包括：①MTB被先天和/或获得性免疫清除；②潜伏性感染（最常见）；③快速进展为活动性结核病；④通过早期和亚临床阶段缓慢进展为活动性结核病；⑤处于早期和亚临床状态的循环期。MTB生长繁殖特点与致病性密切相关，宿主体内 MTB生长繁殖较快时毒力及致病性强，更易出现活动性结核病症状。因此，结核病病程、疾病严重程度、内源性激活风险等可以借助宿主体内MTB分子钟量化识别MTB繁殖特点进行推断。

本研究首次应用全基因组测序（WGS）技术探索宿主室外空气污染物暴露对宿主体内MTB内源性再激活过程中MTB微进化分子钟速率的影响来评估MTB的繁殖活动状态，旨在从微观角度揭示宿主空气污染物暴露对结核病发生、发展的影响，以期弥补既往宏观时间序列、生态学研究无法控制的一系列混杂，揭示空气污染物暴露对结核病发病风险的真实影响，为制定结核病防控策略提供理论指导依据。

研究方法

收集江苏省和四川省的三个回顾性队列研究中包含初治—复发菌株的结核病患者病案信息，并对MTB菌株进行复苏转种和使用Illumina高通量测序平台NovaSeq 6000进行WGS。结核病复发可能是由内源性激活（endogenous relapse）导致，也可能由外源性再次感染（exogenous reinfection）引起。本研究将初治—复发样本全基因组遗传距离≤12个单核苷酸多态性（SNP）差异判断为内源性激活复发，否则判为外源性再次感染。采用广义相加模型（GAM）来估计从暴露滞后0~1个月至0～12个月内6种室外空气污染物（PM10、PM2.5、SO2、NO2、O3、CO）暴露浓度对MTB基因组单位时间内突变率（分子钟）的影响。结果表示为比值比（Odds Ratio，OR）/百分比变化（Percentage Change， PC）和95%可信区间（Confidence Interval，CI）。

研究结果

1. 研究人群：来源于三个回顾性队列研究。①2011.1.1-2020.12.31江苏省连云港市招募2252例痰培养阳性的结核病患者；②2013.8-2015.12江苏省4个地级市（徐州、南通、常州、泰州）定点治疗医院招募2098例痰培养阳性的结核病患者；③2009.1.1-2020.12.31四川省武胜县登记1728例痰培养阳性的肺结核患者。排除非结核分枝杆菌感染患者、测序失败样本、初治失败和外源性再感染结核病患者，进一步考虑气象和环境污染物的常规监测从2014.1.1正式开始，最终纳入可获得初治—复发配对分离菌株的99例结核病患者进行分析。

2. 低分子钟速率组和高分子钟速率组的临床特征和微生物学发现：99例结核病患者中，根据分子钟速率中位数进行分组，49例（49.50%）为低分子钟速率组（<2.72×10−10 mutations/bp/generation），50例（50.50%）为高分子钟速率组（≥2.72×10−10 mutations/bp/generation）。低分子钟速率组和高分子钟速率组的初治—复发时间间隔中位（IQR）时间分别为18.67（13.43，34.30）和22.93（15.39，39.01）个月。男性85例（85.86%），女性14例（14.14%）。复发年龄范围为20~86岁，低分子钟速率组中位年龄（IQR）为66.00（54.00，72.00）岁，高分子钟速率组中位年龄（IQR）为62.00（53.75，70.50）岁。未发现低分子钟速率组和高分子钟速率组之间的宿主临床特征（性别、年龄、治疗方案、肺空洞、糖尿病、初治—复发时间间隔）和微生物学特征（MTB谱系、二月末痰检结果、耐药情况）存在统计学差异。

3. MTB谱系和系统发育关系：谱系L2和L4谱系菌株占比分别为75.76%、24.24%。存在7个亚谱系，67个（67.68%）L2.2.1亚谱系、7个（7.07%）L2.2.2亚谱系、2个（2.02%）L4.2、2个（2.02%）L4.2.2亚谱系、4个（4.04%）亚谱系L4.4、10个（10.10%）4.4.2亚谱系、7个（7.07%）L4.5亚谱系（表1）。

此外，本研究对初治—复发配对的198个MTB全基因组序列基于最大似然法构建系统进化树。初治—复发配对MTB菌株中，初治—复发配对MTB菌株及其谱系在系统发育树上彼此相邻，表明初治—复发配对MTB菌株均是由宿主体内单株菌株内源性激活复发，排除了混合感染和再次感染其他菌株的情况（图1）。

图1  初治—复发配对的198株MTB菌株系统发育和耐药情况

表1 根据宿主体内MTB分子钟中位数（2.72×10−10 mutations/bp/generation）进行分组比较结核病患者的临床和微生物学特征差异

4. 单污染物模型中室外空气污染暴露对宿主体内MTB分子钟速率影响：室外PM10暴露滞后0~1月至0~12月内随着PM10浓度增加，MTB分子钟速率显著上升。暴露滞后0~12月时效应最大，PM10每上升10 μg/m3，MTB分子钟速率增加81.87%（95% CI：38.38，139.03）（见图2）。

室外PM2.5暴露滞后0~5月至0~12月内随着PM2.5浓度增加，MTB分子钟速率显著上升。暴露滞后0~12月时效应最大，PM2.5每上升10 μg/m3，MTB分子钟速率增加73.91%（95%CI：22.17，147.55）（见图2）。

室外SO2暴露滞后0~1月至0~12月内随着SO2浓度增加，MTB分子钟速率显著上升。暴露滞后0~7月时效应最大，SO2浓度每上升10 μg/m3，MTB分子钟速率增加132.2%（95%CI：49.45，260.76）（见图2）。

室外NO2暴露滞后0~1月至0~12月内随着NO2浓度增加，MTB分子钟速率显著上升。暴露滞后0~9月时效应最大，NO2浓度每上升10 μg/m3，MTB分子钟速率增加124.02%（95%CI：34.5，273.14）（见图2）。

然而，室外O3暴露滞后0~6至0~12月内O3与分子钟速率变化呈负相关关系。O3浓度每上升10 μg/m3，暴露滞后0~9月时效应最大，O3分子钟速率降低6.18%（95%CI：-9.24，-3.02）（见图2）。

室外CO暴露滞后0~1月至0~12月内均未发现室外空气CO浓度水平与MTB分子钟速率变化有统计学关联（见图2）。

图2 单污染物模型中室外空气污染暴露对宿主体内MTB分子钟速率的影响

5. 多污染物模型中室外空气污染暴露对宿主体内MTB分子钟速率影响：室外PM10暴露滞后0~3月至0~12月内随着PM10浓度增加，MTB分子钟速率显著上升。PM10暴露滞后0~12月时效应最大（92.16%，95%CI：41.99，160.06）（见图3）。

室外PM2.5暴露滞后0~5月至0~12月内随着PM2.5浓度增加，MTB分子钟速率显著上升。PM10暴露滞后0~9月时效应最大（67.41%，95%CI：17.59，138.33）（见图3）。

室外SO2暴露滞后0~1月至0~10月、0~12月内随着SO2浓度增加，MTB分子钟速率显著上升。SO2暴露滞后0~8月时效应最大（248.02%，95%CI：88.10， 543.89）（见图3）。

室外NO2暴露滞后0~6月至0~10月内随着NO2浓度增加，MTB分子钟速率显著上升。NO2暴露滞后0~9月时效应最大（234.23%，95%CI：80.21，519.87）（见图3）。

室外O3暴露与MTB分子钟速率变化呈负相关关系（暴露滞后0~4月至0~5月、0~7月至0~11月）。O3暴露滞后0~9月时效应最大（-11.58%，95%CI：-18.73，-3.80）（见图3）。

同样，CO暴露滞后0~1月至0~12月内均未发现室外空气CO浓度水平与MTB分子钟速率变化有统计学关联（见图3）。

图3 多污染物模型中室外空气污染暴露对宿主体内MTB分子钟速率的影响

研究结论

随着宿主室外空气污染物（PM10、PM2.5、SO2和NO2）暴露浓度增加，MTB基因组分子钟速率显著上升，表明MTB表现出更强的繁殖活性，从而加速宿主体内MTB内源性激活和活动性结核病发病进程。随着O3暴露浓度增加， MTB基因组分子钟速率显著降低，表明O3可通过抑制宿主内MTB内源性激活而引起较低的MTB繁殖活性，达到抑制活动性结核病发病进展的作用。

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供稿：陶必林

编辑：于菲

审校：范永德

发布日期：2023-04-03