全面认识T细胞免疫

适应性免疫系统针对不同病原体的生活方式发展出了多种多样的应对机制。淋巴细胞能够识别感染性病原体的特定结构（抗原），这在大多数情况下会导致这些病原体被清除，并提供终身防止再次感染的保护。由B细胞产生的抗体可以结合游离的抗原，因此主要针对胞外病原体及其毒素产物。相反，胞内病原体或肿瘤细胞的抗原必须经过处理并以MHC分子为背景呈递给T细胞的抗原受体（即T细胞受体，TCR）进行识别。

细胞毒性T细胞

细胞免疫系统中的T细胞可以通过其表面分子CD4和CD8的表达来区分。CD4+ T细胞，也称为T辅助细胞，激活巨噬细胞（Th1细胞）或B细胞（Th2细胞），这些细胞通过MHC II分子呈递相应的抗原，并使它们能够对抗感染。除了Th1和Th2细胞外，还发现了一种产生IL-17的第三类T辅助细胞。这种所谓的Th17细胞表现出与Th1和Th2细胞不同的效应功能，因此被认为可以清除Th1和Th2细胞无法充分处理的病原体。此外，Th17细胞是强有力的组织炎症诱导者，并且已被证明参与了许多实验性自身免疫疾病和人类炎症状况。另一方面，控制细胞内病原体或肿瘤依赖于CD8+ T细胞与呈递抗原的细胞之间的直接相互作用。在遇到抗原后，幼稚的CD8+ T细胞增殖并分化为效应细胞，即细胞毒性T细胞（CTL）。在CD8+ T细胞和靶细胞的接触区域，T细胞和抗原呈递细胞的表面分子聚集形成一个高度有序的界面，称为免疫突触。在此过程中，表面受体分隔成三个同心区室：中央、外周和远端超分子活化复合物（SMACs）。在远端SMAC中发生肌动蛋白积累，在外周SMAC中，T细胞上的非特异性粘附分子LFA-1与靶细胞上的细胞间粘附分子（ICAM）结合（图1.1）。然而，TCR信号传导的主要部位被认为位于中央SMAC（cSMAC），因为在该区域富集了TCR及其相关信号传导蛋白，包括TCRζ、Lck、Zap-70和PKCθ。

图1.1 免疫突触的组成：CTL与靶细胞接触区域的Z截面示意图从侧面（上图）和顶视图展示，附有参与分子的环状组装图（下图）。

信号传导发生后，肌动蛋白和微管细胞骨架向突触极化是细胞毒性的关键步骤，因为效应分子的释放集中在与靶细胞接触的部位。极化由接触点处的肌动蛋白细胞骨架局部重组启动，这进而导致微管组织中心（MTOC）和高尔基体（GA）的重新定向。来自高尔基体的溶酶体颗粒特异性地迁移到MTOC，而MTOC始终与质膜在cSMAC处接触。形成分泌区域后，颗粒中包含的细胞毒性效应分子随后在质膜上释放，启动所谓的"致命打击"。

这些细胞毒性效应分子之一是穿孔素，它在靶细胞膜上聚合形成孔洞。水和盐可以通过这些孔洞进入细胞，导致细胞渗透性裂解。然而，为了有效杀死细胞，另一类称为颗粒酶的细胞毒性蛋白质是必需的。颗粒酶属于丝氨酸蛋白酶家族，通过穿孔素形成的孔洞进入靶细胞并诱导细胞凋亡。除了穿孔素介导的细胞毒性外，还存在一种不依赖于穿孔素的T细胞细胞毒性机制。例如，跨膜受体Fas配体（CD95L）也从裂解颗粒中释放出来，通过与靶细胞上的Fas（CD95）结合诱导细胞凋亡。

细胞毒性T细胞释放的细胞因子也有助于宿主防御。IFNγ抑制病毒复制并激活其他免疫细胞，如巨噬细胞，并将它们招募到感染部位。肿瘤坏死因子α和β (TNFα和TNFβ) 与IFNγ协同作用，通过结合表面受体TNFR-I来激活巨噬细胞或杀死细胞。

在清除病原体后，大多数效应T细胞迅速死亡，以防止免疫系统被大量"无用"的细胞过载。然而，一小部分T细胞存活下来，成为持久的记忆T细胞，在没有抗原的情况下持续存在。在二次感染时，记忆T细胞在遇到抗原后立即被激活，并伴随特异性T细胞的快速增殖，从而防止病原体的新一轮扩展。已报道两种可以通过不同表面标志物区别的记忆T细胞亚群。中央记忆T细胞（TCM）表现出高表达淋巴归巢受体CCR7和CD62L，而效应记忆T细胞（TEM）则这两种受体的表达较低。TCM被认为对持久的保护性免疫至关重要，因为它们在再感染后表现出高的增殖潜力。然而，TCM向效应细胞的转化往往不够迅速，尤其是在面对像李斯特菌这样的快速增殖病原体时。因此，为了对快速增殖的病原体提供即时的保护能力，必须有足够的TEM存在于感染部位。为了解不同T细胞记忆亚群是否有一个共同的祖细胞或独立发展，研究人员将一个单一的、幼稚的抗原特异性CD8+ T细胞转移到小鼠体内，随后进行微生物挑战。这导致了克隆扩增并发展出效应T细胞和中央记忆T细胞亚群，揭示了单个幼稚T细胞作为共同祖细胞。

总之，细胞毒性T细胞能够特异性识别感染或异常细胞，并能够高效且有方向性地杀死它们，而不会对未感染的细胞造成损害。持久的记忆T细胞能够在再次受到相同病原体挑战时提供保护。然而，效应功能的前提是TCR与其配体（负载肽段的MHC复合物）成功结合。

TCR配体相互作用

T细胞如何识别抗原并参与免疫反应的问题一直是免疫学发现历史中不同理论和讨论的基础。在证明来自胸腺的细胞（称为T细胞）提高了B细胞产生抗体的效率后，人们认为T细胞通过与B细胞的协同作用来发挥作用，即T细胞识别抗原的一个决定簇，然后帮助B细胞针对同一分子的第二个决定簇产生抗体。然而，这种观点未能解释MHC的作用，而MHC已被确定为负责对移植物或肿瘤的免疫反应。此外，实验表明T细胞识别的是与细胞相关的抗原，而不是可溶性抗原。1974年，Zinkernagel和Doherty通过细胞裂解实验取得了对T细胞抗原识别理解上的突破。他们发现，T细胞只有在与靶细胞共享至少一组H-2抗原特异性的情况下，才能在体外裂解感染的细胞。这使他们得出结论：T细胞必须同时识别抗原和MHC分子，因为"只有在这种情况下，才能实现必要的接触亲密性"。1981年，通过一个双TCR T细胞杂交实验进一步澄清了是否两个不同的T细胞抗原受体参与识别，或者一个单一的受体结合抗原和MHC。携带两个TCR的T细胞，分别针对两种不同的抗原-MHC组合（抗原a + MHC A和抗原b + MHC B），无法与混合组合（抗原a + MHC B和抗原b + MHC A）发生反应，这表明单个TCR必须对特定的抗原和MHC组合作出反应。自1996年首次发表TCR的晶体结构以来，TCR和MHC的结构及其分子相互作用已得到了详细研究。

TCR结构

在第一个晶体结构出现之前，序列分析预测TCR将类似于抗体分子的膜结合Fab片段。X射线晶体学分析随后证实TCR和Fab片段的结构具有多个共同特征。TCR由两条不同的跨膜肽链组成，即TCRα链和TCRβ链，这两条链通过二硫键连接。两条链均包含一个可变（V）区和一个恒定（C）区，这些区域分别与免疫球蛋白的V区和C区显示出同源性（图1.2）。然而，TCRα链的C区有一个不寻常的折叠模式。与抗体或Cβ区中的β片层三明治结构不同，其中二硫键连接两个β片层，TCRα链中的二硫键形成螺旋结构，这与其他任何类似免疫球蛋白的结构都不同。在C区旁边是一个含有半胱氨酸残基的短铰链区，该残基形成α链和β链之间的二硫键。最终，每条链通过疏水性跨膜区穿过脂质双层，并以一个短的胞质尾结束。不同寻常的是，跨膜区中含有带正电荷的氨基酸，这些氨基酸与不变信号链CD3和ξ的跨膜区相互作用，从而形成TCR复合物。

图1.2 αβTCR的结构：(a) 不同TCR结构域的示意图和 (b) 以2.5Å分辨率解析的αβTCR的晶体结构。CDR环由数字1-3表示。

α链和β链的V区类似于抗体配对，形成不同TCR之间高度可变的区域。每条链包含三个高变环，称为互补决定区（CDR），这些环位于相对平坦的顶部并构成抗原结合位点。TCR库的多样性是通过T细胞成熟过程中α链和β链多个基因片段的体细胞重组生成的。人类α链和β链的CDR1和CDR2由42个Vα基因和46个Vβ基因编码，而CDR3则在α链的V-和J-基因片段连接后组装，或在β链的V-、D-和J-基因片段连接后组装。除了不同基因片段的组合外，多样性还通过在连接反应中插入P-和N-核苷酸增强。因此，CDR3区域表现出最高的多样性。这与结构模型一致，即高度可变的CDR3与（同样高度可变的）肽结合，而相对不太可变的CDR1和CDR2与相对不太可变的MHC分子结合。

MHC结构

主要组织相容性复合体（MHC）最初是在小鼠中被确定为负责移植接受或排斥的基因位点。在近交系小鼠的研究中发现，单个基因位点的差异会导致皮肤移植的快速排斥，因此这些基因被称为"组织相容性基因"。多个紧密连锁且高度多态性的基因被证明是组织相容性的主要决定因素，并被概括为主要组织相容性复合体。可以区分两类MHC，它们表达在不同的细胞类型上，并结合不同类型的肽段。

MHC I类分子表达在所有体细胞上，将胞质中降解的蛋白质衍生的肽段呈递给 CD8+ T细胞。外来胞质蛋白来源于胞内细菌或病毒，MHC负载肽段的识别会导致感染细胞被杀伤。MHC II类分子表达在更有限的细胞亚群上，主要是与CD4+ T细胞相互作用的抗原提呈细胞。与MHC I类分子不同，它们结合来自胞外抗原的肽段，例如被巨噬细胞吞噬的抗原。CD4+ T细胞的识别会激活B细胞和巨噬细胞。除了上述经典的MHC分子，其表现出高度多态性分布外，还存在多态性变异较少的非经典MHC。

人类MHC I类分子由一个跨膜的重链糖蛋白组成，该糖蛋白大约为44kD，一个可溶性蛋白为16kD，称为β2-微球蛋白（β2m），以及一个由胞质蛋白衍生的8-10个氨基酸残基组成的肽段。抗原肽的结合位点由重链中的两个α螺旋，即α1和α2结构域，构成一个溶剂暴露的沟槽。α3结构域位于α1和α2之下，并通过其跨膜区域将重链连接到质膜。β2m与MHC的结合是通过非共价键与重链结合实现的。研究表明，肽段与结合沟槽的结合对于维持MHC I类分子的稳定组装至关重要，这是特异性TCR识别的必要条件。

TCR和pMHC的分子相互作用

TCR与其对应的肽-MHC（pMHC）配体之间的相互作用对于不同类型的细胞间接触至关重要。如前所述，TCR与pMHC的结合是启动T细胞效应功能的重要步骤。此外，在胸腺中T细胞发育过程中，TCR/pMHC相互作用通过正选择和负选择决定了TCR库的构成。在外周，TCR与pMHC的接触对于维持T细胞存活是必需的。晶体学研究揭示了TCR/p/MHC复合物的精确结构，并阐明了病毒抗原识别、激动剂和拮抗剂配体识别以及移植物排斥中的异反应性机制等原理。在1996年首次解析出αβ TCR与其对应pMHC配体的晶体结构后，已生成了相当数量的I类和II类TCR/pMHC复合物数据库。

不同TCR与pMHC I或pMHC II结合时，TCR/pMHC的方向显示出轻微的变化，TCR以45°到80°的角度位于pMHC表面之上。方向的差异取决于全局参数，如TCR在pMHC表面上的扭转、倾斜和位移，Vα和Vβ结构域之间的不同角度以及CDR环的构象和长度。然而，小鼠和人类的TCR/pMHC复合物都具有一种共同的对接模式。TCR的Vα结构域总是位于抗原肽的N端附近，而Vβ结构域则靠近肽的C端。这导致TCR在pMHC表面上呈对角线方向。对角线方向显然用于在MHC的反平行α螺旋的N端区域之间产生距离，这些区域代表了pMHC表面的最高点。由于TCR表面相对平坦，MHC α螺旋之间的这些高点的结合使得TCR和pMHC之间能够形成较大的界面。图1.3展示了假设的αβ TCR/pMHC/CD3εδ/CD3εγ/CD8复合物结构。TCR α链和β链的CDR2区域仅与MHC分子接触，而CDR1和CDR3环则同时与MHC分子和肽结合。由于CDR3环表现出最高的多样性，因此早就怀疑它会与pMHC复合物中最具多样性的部分--抗原肽结合。后来这一点在大多数结构中得到了验证，其中位于中心的CDR3环主导了与pMHC复合物的相互作用。

图1.3 假设的TCR/pMHC/CD3εδ/CD3εγ/CD8复合体：TCR/pMHC-CD8αα和假定的CD8αβ相互作用是通过叠加两个结构建模的，即HLA-A2/CD8αα复合体和TCR A6/HLA-A2/Tax P6A复合体在其MHC残基α1180上，其中TCR（绿色），MHC（深蓝色），肽（红色）和CD8（黄色和橙色）。CD3εδ（粉红色和蓝色）和CD3εγ（金色和蓝色）显示在图的顶部对接，共同的ε链为蓝色。线条用于描绘连接不同亚基到TCR细胞膜（顶部，绿色）或抗原呈递细胞膜（底部，棕色）的系绳。

即使在pMHC表面存在已知的TCR足迹，也无法预测实际接触的是哪些氨基酸。从TCR/pMHC复合物的晶体结构中得知，有31个氨基酸可能是潜在的结合伙伴。然而，在每个单独的复合物中，实际上只有大约一半参与了相互作用，并且即使在同一pMHC分子与不同TCR之间的接触中，这种模式也只保留了一个共同的氨基酸。这种效应是由TCR相对于pMHC复合物的不同取向引起的。目前，根据TCR和pMHC复合物的序列来预测这些全局参数或结合细节是不容易的，尽管在不同结构之间已经发现了共同特征。

MHC复合物中存在保守残基，但TCR的结合并不保守，这一表观矛盾促使了不同假说的发展。组合机制理论认为，不同的TCR接触不同的MHC亚集，因为存在许多不同的保守MHC残基和许多编码TCR的不同基因。然而，即使具有相同CDR1和CDR2环的TCR也被证明与MHC分子有不同的相互作用。另一种理论提出，在TCR和MHC共同进化过程中，选择了一部分能够进行信号传导的TCR。任何启动信号传导所需的结合模式都会被保留，而不论氨基酸序列如何。有研究者证明，TCR必须与MHC侧链上的某些"热点"相互作用，以逃脱胸腺中的阴性选择。此外，一些pMHC残基对TCR特异性有贡献，即使这些侧链并未对结合亲和力产生影响。这些"中断侧链"提示了为什么TCR倾向于在给定的pMHC位置结合特定的氨基酸。

TCR对外源抗原的识别仅限于整个肽段的大约1/3，因为MHC结合的肽段其他部分被掩埋，无法与TCR接触。在某些情况下，TCR在一个相对平坦的表面上与肽侧链接触。在其他情况下，肽的残基被TCR中的一个中央腔所包围，该腔由Vα和Vβ链的CDR3环构成。由于TCR与抗原肽之间的接触点有限，交叉反应性可能通过同一个TCR结合到同一MHC上的不同肽而发生。使用改变的肽配体（APL），即具有单个氨基酸替换的肽，测试了其对信号传导结果的影响。研究表明，即使是在不直接参与TCR结合的氨基酸中，肽序列的微小变化也可能将一个强激动剂pMHC配体转变为弱激动剂或甚至拮抗剂。在3个TCR/APL/MHC复合物的结构研究中观察到了TCR/肽界面的微小结构变化，也称为诱导契合。这些变化对外部TCR表面没有影响，且结构重排的程度与信号传导结果之间无法建立关联。这些结果支持了以下建议：TCR结合的紧密性和持续时间，而不是TCR/pMHC复合物中的不同构象，决定了不同的信号传导结果。

如前文所述，表达外源MHC分子的移植细胞会被免疫系统迅速排斥。这种反应由异反应性T细胞执行，即识别外源MHC的T细胞。值得注意的是，高达10%的外周T细胞参与此类异反应，这一比例与大约1%的外周T细胞对病毒挑战的正常反应相比，显得非常显著。为了解释这种高反应性，提出了两种模型。一种解释是TCR在异反应中主要结合异体MHC分子的多态性和保守残基。另一种模型则认为，由于异体MHC能够结合新的自身肽组合，因此会产生许多新的自身肽MHC配体。由于异体MHC在胸腺选择过程中不存在，T细胞不会因这些新复合物的负选择而被消除。TCR与异体MHC结合的晶体结构显示，TCR同时结合肽和MHC复合物，从而支持第二种模型。其他模型也支持这样的结论，即异体识别的原则与其他TCR反应相似，招募的T细胞频率较高只是因为产生了新的肽/异体MHC复合物。

TCR复合体的组装

除了TCR与其对应的pMHC配体之间的相互作用外，还有几项其他相互作用共同组装免疫突触。通过TCR、其共受体CD4或CD8以及额外的信号分子如CD3之间的相互作用，初始化了一个具有信号传导能力的复合物。下文将总结目前对CD3和CD8在CD8+ T细胞的TCR-配体相互作用中所起作用的认识。

TCR能够识别并结合其pMHC配体，但不能向细胞传递信号。为了实现信号转导，αβ TCR链与6个辅助链相关联，这些辅助链称为CD3信号模块。δ、ε、γ和ζ亚基通过非共价键结合形成ζζ同源二聚体以及异源二聚体CD3εδ和CD3εγ。每个CD3链包含一个ITAM（免疫受体酪氨酸激活基序），每个ζ链包含三个ITAM，用于细胞内信号转导。据认为，CD3ε亚基的构象变化对于早期TCR信号事件至关重要。此外，αβ TCR的正常发育及其在细胞表面的稳定表达依赖于CD3成分的存在。图1.3展示了假设的αβ TCR/pMHC/CD3εδ/CD3εγ/CD8复合物结构。

CD8共受体与pMHC复合物的相互作用是细胞毒性T细胞发育和功能的关键步骤。细胞表面表达的CD8可以组装成同源二聚体CD8αα或异源二聚体CD8αβ。CD8αα与pMHC复合物的晶体结构显示，CD8同源二聚体以类似抗体的方式结合到MHC分子的α3结构域。确定CD8αβ异源二聚体的晶体结构被证明更为困难。小鼠CD8αα和CD8αβ的Ig样结构域在大小、形状和pMHC I结合区域的静电势方面相似，表明这两种CD8变体与pMHC I的相互作用相似。然而，尽管结构相似，CD8αα和CD8αβ在组织分布、配体特异性和抗原提呈效率方面表现出显著差异。CD8αα广泛表达，包括αβ TCR+和γδ TCR+肠淋巴细胞、NK细胞和DC细胞，而CD8αβ主要表达在αβ TCR+ T细胞表面，可被视为真正的αβ TCR共受体。CD8αβ对早期T细胞激活的增强作用通过不同的机制介导：① CD8αβ将TCR定位到被认为有利于TCR信号传导的膜域；② 它招募必需的信号分子到TCR/CD3/ζ复合物的细胞内位点；③ 它在细胞表面稳定TCR-pMHC相互作用约十倍。此外，研究表明CD8影响TCR-pMHC结合的结合速率（kon）和解离速率（koff）。研究显示这些动力学参数决定了抗原结合在功能水平上的后果，也称为T细胞亲和力。

下期全面认识T细胞亲和力。

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