司美格鲁肽高级结构确证方法综述

司美格鲁肽（Semaglutide）作为GLP-1受体激动剂的代表药物，近几年在国内外市场上热度不断攀升，它所受到的关注，不仅来源于其显著的降糖效果，更因其减重适应症的获批。2024年，诺和诺德的减重版司美格鲁肽（商品名“诺和盈”）在国内上市，上市两月斩下2800万美元销售额。而随着中国超重肥胖人群达7.8亿的庞大市场需求，司美格鲁肽成为国内药企竞逐的“黄金赛道”。

随着诺和诺德的专利将于2026年到期，大批药企将争先进入这一赛道之中，目前，国内已有20余家药企布局司美格鲁肽生物类似药，包括华东医药、丽珠集团、联邦制药等，多款产品进入Ⅲ期临床阶段。

01 高级结构确证：生物类似药申报的“必答题”

根据CDE《生物类似药研发与评价技术指导原则》与《生物类似药相似性评价和适应症外推技术指导原则》， 对生物类似药的申报程序、注册类别和申报资料等相关注册要求进行了规范：

“理化鉴定应包括采用适宜的分析方法确定一级结构和高级结构（二级/三级/四级）以及其他理化特性。还应考虑翻译后的修饰可能存在差异，如氨基酸序列N端和C末端的异质性、糖基化修饰（包括糖链的结构和糖型等）的异同。应采用适宜的方法对修饰的异同进行比对试验研究，包括定性和定量分析研究。”

“生物类似药在开发过程中需要经过严格的质量相似性评价，其中包括对蛋白结构和理化特性、纯度和杂质、生物学活性、免疫学特性以及稳定性等方面的评估。

对低风险和无法采用定量方法评价的质量属性（如一级结构、高级结构），可采用头对头定性比对或图谱比对的方法进行评估。”

同样，在海外市场，FDA对生物类似药（Biosimilar）也做出了有关研发与申报的法规要求，根据《FDA Guidance: Scientific Considerations in  Demonstrating Biosimilarity to a Reference Product》

“CMC研究：对生物类似药与其参照药进行广泛的结构和功能特性鉴定是生物类似药研发项目的基础”

由此可见，进行司美格鲁肽防治药品的开发，针对其高级结构的研究分析是进行药物申报时必不可少的数据。

02 高级结构数据：CDE评审中细致关注的焦点

2024年8月，国家药品监督管理局药品审评中心在《中国生物制品学杂志》发文，对审评实践中司美格鲁肽生物类似药的药学评价中常见问题进行了分析探讨，在司美格鲁肽的高级结构上关注了许多细致的问题。

糖基化修饰

 若采用酵母表达系统，由于真核表达系统生物学过程较复杂，对分泌的蛋白会进行糖基化修饰，结构表征应对糖基化修饰进行研究，研究内容包括糖基化位点、糖型（O 连接糖／N 连接糖）等，应关注糖基化修饰的批间一致性，因为糖基化修饰的一致性在一定程度上反应了生产工艺，特别是发酵工艺的批间一致性。

脂肪酸酰化侧链的链修饰位点

司美格鲁肽的脂肪酸酰化侧链的脂肪酸侧链、连接子和间隔子分别为1个1，18‐十八烷脂肪二酸、1个 γ‐谷氨酸基团和 2 个 8‐氨基‐3，6‐二氧杂辛酸基团。

脂肪酸酰化侧链部分应提供酰化剂、二肽和PyBOP等主要生产用原材料和生产涉及的特殊有机溶剂的来源、制备工艺、毒性研究背景、结构（包括手性）确证、杂质分析以及质控标准和依据等方面的资料。对脂肪酸酰化侧链的链修饰位点进行研究确认，对酰化侧链进行结构确证和功能研究，应对其酰化侧链空间、位置异构体和手性异构体进行充分的鉴定和研究，提升对产品的认知及质量控制能力。

司美格鲁肽前体

重组表达的司美格鲁肽前体作为本品关键的中间产物，应进行充分的结构确证、质量控制和稳定性研究。

这些CDE在文章中重点提到的问题，后续可能会成为司美格鲁肽仿制药申报和评审中会被重点关注的问题。

03 技术破局：三大手段破解高级结构的密码

常用的大分子高级结构研究手段包括核磁共振波谱法（NMR）、X射线晶体学（X-Ray）、冷冻电镜单颗粒分析法（Cryo-EM SPA）。  

X射线晶体学

利用X射线穿透晶体时产生的衍射图案，通过傅里叶变换反推出电子密度图，再拟合原子坐标。X射线晶体学是目前极为成熟的结构解析手段，能获得高分辨率的结构数据，但所解析样品必须具有结晶性，并可长出微米级尺寸的高质量晶体。

Jesper Lau等[1] 对未酰化的司美格鲁肽骨架进行了结构解析，获取了1.8 Å的结构数据。作者也尝试对完整的司美格鲁肽与 GLPS1 受体胞外结构域复合物进行结构解析，但由于晶体衍射结果较差，未能获得理想结果。

冷冻电镜单颗粒分析法（Cryo-EM SPA）

将样品速冻形成玻璃态冰，通过电子束成像收集投影图像，利用单颗粒分析技术重构三维结构。冷冻电镜无需样品形成晶体，溶液状态的样品即可进行数据收集，特别适合分子量超大的大分子单体或复合物，以及难结晶的大分子样品。

Zhang等[2]对司美格鲁肽与GLP-1受体-Gs蛋白复合物的完整结构进行表征。

NMR

基于原子核在强磁场中的自旋特性，通过射频脉冲激发核磁共振信号，分析分子内原子间的空间关系（如NOE效应），重构三维结构。NMR可以检测溶液状态中的样品的天然构象，对样品本身要求不高。但对于超大分子（>50 kDa）样品，会增加其分析图谱的复杂程度，一般情况下不推荐使用。

使用NMR解析司美格鲁肽的文章较多，在此处我们仅以具有代表性的文章为例。

 Yu Liu, Yunxiao Zhang et等[3]对司美格鲁肽的中间体进行了结构表征。

Antonio Ricci 等[4]对司美格鲁肽的脂肪酸侧链进行了结构表征。

Detlefsen, D.J.等[5]则分析了司美格鲁肽完整的结构数据。

如何选择合适的技术手段进行结构解析，各家企业可以结合自己的研发阶段和需求，早期研发优先NMR快速验证，终产物及复合物推荐Cryo-EM或X射线晶体学。

★ 参考文献：

[1] Lau J. et al. Discovery of the Once-Weekly Glucagon-Like Peptide-1 (GLP-1) Analogue Semaglutide. J Med Chem. 2015 Sep 24;58(18):7370-80. doi: 10.1021/acs.jmedchem.5b00726. Epub 2015 Sep 11. PMID: 26308095.

[2]  Zhang et al. Structure and dynamics of semaglutide- and taspoglutide-bound GLP-1R-Gs complexes. 2021, Cell Reports 36, 109374. doi:10.1016/j.celrep.2021.109374

[3] Yu Liu, Yunxiao Zhang et al.  A two-step method preparation of semaglutide through solid-phase synthesis and inclusion body expression. Protein Expression and Purification, Volume 219, 2024, 106477, ISSN 1046-5928. doi: 10.1016/j.pep.2024.106477

[4] Antonio Ricci et al. Improving Solid-State Properties of the Side-Chain Peptide Building Blocks for the Synthesis of GLP-1 Analogs through Their Complexation with Metal Cations. Organic Process Research & Development 2025 29 (3), 785-793. doi: 10.1021/acs.oprd.4c00515

[5] Rogers-Crovak, J.A., Delaney, E.J. & Detlefsen, D.J. Recommendation for Clarifying FDA Policy in Evaluating “Sameness” of Higher Order Structure for Generic Peptide Therapeutics. AAPS J 27, 8 (2025). doi: 10.1208/s12248-024-00994-8