优化流式细胞分析的关键——FcR阻断剂

Fc Receptor

流式细胞术通过荧光标记抗体特异性的识别细胞或细胞亚群，从而在流式细胞仪中进行检测和区分。标记抗体的Fab段进行特异性识别，但所有抗体中高度保守区Fc段也会被部分细胞识别，识别免疫球蛋白（Ig）Fc段的蛋白即为Fc受体（Fc Receptor）。

Fc受体存在于多种免疫细胞的表面，包括单核细胞、巨噬细胞和DC细胞、嗜酸性粒细胞，嗜碱性粒细胞、中性粒细胞、髓系细胞、B细胞表面、NK细胞等等，在免疫细胞表面发挥多种关键功能：

吞噬作用：免疫细胞如巨噬细胞和中性粒细胞通过Fc受体识别并吞噬被抗体包被的微生物，这是一种重要的先天免疫防御机制。

溶酶体降解：吞噬后的免疫复合物被运输到溶酶体内，溶酶体中的酶类能够降解病原体和其他异物，完成病原体的清除过程。

细胞毒作用：自然杀伤细胞等通过Fc受体识别被抗体标记的细胞，释放细胞毒性颗粒。

细胞因子和趋化因子的分泌：激活的免疫细胞能够分泌细胞因子和趋化因子，有助于调节免疫反应，吸引其他免疫细胞到感染或炎症部位。

图1 免疫细胞表面FC受体的功能

FcR根据它们结合的免疫球蛋白类型被分为不同的类别：IgG的Fc受体（FcγR）、IgE的Fc受体（FcεR、IgA的Fc受体（FcαR）、IgM的Fc受体（FcμR）和IgD的Fc受体（FcδR）。

日常实验中使用的多是IgG类型的单抗，其Fc受体（FcγR）根据亲和力强弱可分为三个亚家族：FcγRI（CD64）、FcγRII（CD32）和FcγRIII（CD16）。

图2 FcγR 家族和表达模式

FcR阻断

在流式实验中细胞表面表达的多种FcγR易与抗体FC段结合，出而出现非特异性染色，导致分析中容易出现高背景或甚至假阳性信号。为获得正确的阳性细胞群，可以先加入封闭试剂孵育细胞，占据结合位点阻断Fc受体与抗体结合，降低检测背景获得更准确的结果。

常见的封闭试剂主要有以下几种：

血清或血清随纯化的IgG

抗CD16/32抗体

抗CD16/32抗体

流式分析人PBMC标记兔单克隆IgG同型对照抗体，孵育30分钟后在冰上PBS（右侧）与Human FcR Blocking Reagent按1/100（1 µg，2.5×10^5细胞在100 µL中）稀释度处理以阻断Fc受体及非特异性蛋白结合，并与未标记对照组（未与一抗和二抗孵育的细胞）（蓝色）进行比较。

流式细胞术分析THP-1细胞标记兔单克隆IgG同型对照抗体，在冰上PBS（黑色）或人类FcR阻断试剂按1/100稀释度（1 µg，2.5×10^5细胞在100 µL中）（红色）孵育30分钟处理，以阻断Fc受体及非特异性蛋白结合，并与未标记对照组（未与一抗和二抗孵育的细胞）（蓝色）进行比较。