定量CAR-T和TCR-T产品中载体拷贝数的ddPCR方法

基因改造T细胞疗法在癌症免疫治疗中展现出巨大潜力。这些T细胞产品通常通过能够永久整合到T细胞基因组的载体进行改造，但这也引发了对插入突变潜在风险的担忧。因此，评估整合载体拷贝数（VCN）作为基因改造细胞产品的关键安全性参数变得至关重要。这里，基于微滴数字PCR（ddPCR）方法，开发了一种稳健的检测方法，用于评估CAR-T细胞和TCR-T细胞产品的VCN。为了准确反映基因改造细胞中的VCN，根据泊松分布统计学理论引入了假定转导效率的计算。调整后的VCN值（VCNadj）还与分选的转基因阳性细胞群体中的VCN值进行了比较，以验证其准确性。该检测方法能够一致且精确地确定细胞产品的平均VCN。通过比较分选的转基因阳性细胞群体中的VCN，验证了改进计算方法能更接近实际转导细胞内的VCN，从而为基因改造细胞产品提供更真实的VCN表示。综上，这里提出了一种可靠且稳健的基于ddPCR的检测方法，用于量化基因改造细胞产品中的VCN。

基因改造的T细胞疗法因其显著的疗效和持久的临床反应而备受关注。CAR-T细胞被改造后可在细胞表面表达合成的CAR受体，使T细胞能够识别并清除表达靶标表面抗原的癌细胞。相比之下，TCR改造的T细胞则利用天然或稍加修饰的TCR来识别肿瘤细胞表面MHC分子上呈现的肿瘤特异性表位。

病毒载体，通常是复制缺陷型γ-逆转录病毒或慢病毒载体，用作引入编码CAR分子或TCR分子的转基因的载体。转导过程会导致转基因稳定整合到细胞基因组中。细胞基因组中整合的转基因数量与CAR-T细胞和TCR-T细胞在临床应用中的疗效呈正相关。然而，整合转基因的拷贝数增加（即载体拷贝数，VCN）同时也伴随着更高的非受控整合风险，可能通过干扰邻近宿主基因转录而引发插入突变。尽管接受基因改造细胞疗法的患者曾报告出现继发性恶性肿瘤，但继发性恶性肿瘤的风险被认为较低，并且与接受标准治疗的患者相比没有显著差异。具有更高VCN的产品可能会增加遗传毒性，因此，仔细监测整合的VCN至关重要，以确定能够在保证理想临床疗效的同时最小化病毒载体遗传毒性和致癌潜力的VCN水平，这也是监管机构在药物产品放行前的要求。

传统上，使用qPCR来测量VCN。该方法依赖标准曲线进行量化，精度有限。最近，为了在临床治疗后测量VCN和监测CAR-T细胞，开发了基于ddPCR的方法，该方法可直接量化目标的绝对数量。基于ddPCR的方法提高了分辨率、精确度和重复性。然而，大多数已建立的检测方法检查并报告的是整体CAR-T细胞产品的VCN，尽管其中只有部分细胞（20%-70%）是被转导的细胞，这导致对实际被转导细胞的VCN产生低估。

这里，我们报告了一种用于精确测量CAR-T细胞和TCR-T细胞产品中VCN的ddPCR检测方法的开发。此外，实施了一个简单的优化步骤，以更准确地反映转导细胞的VCN。结果显示，该检测方法保持了高度的特异性、精确性和可重复性，使其成为推动工程T细胞疗法研究与开发的有价值工具。

方法

1、人外周血单核细胞分离

2、基因工程改造的CAR-T和TCR-T细胞生产

CAR-T细胞在CliniMACS Prodigy上通过13天的生产流程制备。冷冻的PBMCs解冻后进行洗涤，并用TransACT激活48h。随后，细胞被γ-逆转录病毒载体转导，该载体编码CAR20（靶向CD20）或CARIL13R（靶向IL13Ra2），MOI为5。这两种CAR均包含4-1BB（CD137）和CD3ζ信号结构域。

TCR基因修饰的CD8 T细胞通过10天的生产工艺在CliniMACS Prodigy上制备。从冷冻保存的血细胞分离产物中，通过CD4和CD8磁珠的阳性选择富集T细胞（CD4/CD8磁珠比例为1:20），用TransACT激活48h，并用携带嵌合TdT TCR编码序列的γ-逆转录病毒载体以MOI=4进行转导。

收获后，CAR-T细胞和TCR-T细胞均进行了冷冻保存。最终的细胞产品分析VCN。

3、基因组DNA提取与定量

4、PCR引物和探针的设计

ddPCR反应被设定为双重检测，以同时定量插入的逆转录病毒载体拷贝数和人参考基因端粒酶逆转录酶（TERT）的拷贝数。

为了定量逆转录病毒载体的插入，设计了一对引物和探针，专门针对WPRE，该元件通常存在于γ-逆转录病毒或慢病毒载体中，位于转基因的3'-非翻译区（图1）。因此，WPRE可以用作检测插入载体的替代标志物，并可应用于不同的产品。扩增片段已被确认不含有EcoRI限制性内切酶识别位点。这对WPRE引物和探针作为定制检测项目从Bio-Rad订购，其中探针由FAM荧光染料标记。针对参考基因TERT的引物对和探针由Bio-Rad预设计（dHsaCP2500351），其中TERT的探针由HEX荧光染料标记。

退火温度经过优化以确保检测的最佳性能。CAR-T细胞产品用作阳性对照，而非转导细胞作为阴性对照。ddPCR反应在50°C-65°C的退火温度梯度下进行，分为8个区间。根据FAM和HEX通道中阴阳性液滴的分离情况，将最佳退火温度确定为58°C，并在后续的ddPCR实验中使用。

图1 检测特异性。

5、ddPCR

遵循Bio-Rad对ddPCR的一般指南。对于每20mL的ddPCR反应，将不含dUTP的探针Supermix与50ng基因组DNA或5μL质粒DNA、每种引物900nM、探针250nM以及5U EcoRI限制性内切酶混合。反应混合物在室温（20-25°C）下孵育5min，然后根据制造商的说明使用QX200手动液滴生成器生成液滴。乳化液滴被转移到96孔ddPCR板中。标准PCR扩增在C1000热循环仪中进行：95°C预变性10min，40个扩增循环（94°C 30s，58°C 1min），最后在98°C下进行10min的酶失活步骤。温度上升速率为每秒2°C。PCR扩增后，使用QX200液滴读取器和QX Manager 2.0软件分析液滴。

通过QX Manager软件确定了WPRE元件和参考基因TERT的拷贝数。假设每个二倍体细胞含有2个TERT基因拷贝，根据以下公式，将样本的平均VCN（每细胞VCN，称为VCNbulk）计算为靶向WPRE元件与参考TERT基因拷贝数的比值：

6、检测和定量WPRE的下限

逆转录病毒载体质粒编码CAR和WPRE序列，用于确定WPRE的检测和定量限。在每次ddPCR实验前，新鲜制备该质粒的系列稀释液（1:2）。使用dsDNA广谱（BR）试剂盒与Qubit荧光计对未稀释样本的DNA浓度进行定量。根据DNA分子量计算拷贝数，并进一步计算系列稀释样本的拷贝数。将稀释后的样本（范围从2500拷贝到1拷贝/mL）加入ddPCR反应体系后，再通过ddPCR进行分析。无模板对照（NTCs）用于确定空白限（LoB）。LoB、检测下限（LLoD）和定量下限（LLoQ）通过以下公式计算：

7、基于ddPCR的VCN测定法的精密度和线性度

为验证所建立检测方法区分信号与背景噪声的能力，将两种CAR-T细胞产品（CAR-1和CAR-2）的基因组DNA进行系列稀释，并等量掺入从与CAR-T细胞产品相同供体的PBMC中分离得到的人基因组DNA（图2）。使用从非转导PBMC中提取的基因组DNA样品（不含WPRE元件）作为阴性对照。

图2 确定CAR-T细胞产品中的VCN和检测间重复性。

8、细胞分选

9、精化计算

为根据基因修饰细胞的百分比对VCN进行归一化，使用以下公式计算调整后的VCN（VCNadj）：

其中，VCNbulk 是通过 ddPCR 测定的批量 CAR-T 细胞产品中的平均 VCN，而 1-e-VCNbulk 是根据泊松分布计算得出的理论转导效率。

检测特异性

引物和探针被设计为特异性靶向WPRE区域，该区域常用于提高病毒载体中的转基因表达，但不存在于人基因组中（图1A）。首先，确认了引物探针组合对实验室开发的不同含有WPRE的CAR-T和TCR-T细胞产品的特异性（图1B）。仅在转导的细胞产品中检测到WPRE阳性（FAM）液滴（蓝/橙色点，图1B下），而在未转导的对照T细胞中未检测到FAM阳性液滴（图1B上）。然而，TERT参考基因（HEX）在所有样本中均有检测到，除NTC外。此外，阳性与阴性液滴之间的明显分离（图1B）证明了该检测的特异性。

WPRE定量检测的准确性和灵敏度

由于缺乏已知拷贝数的WPRE参考材料，直接评估该检测的准确性变得颇具挑战性。因此，选择使用包含WPRE序列的质粒来评估其准确性。通过ddPCR，在3个不同时间点（每周一次）对双倍连续稀释的样本进行了三重复检测，范围从2500拷贝降至1拷贝/mL。如一维振幅图所示，成功实现了阳性与阴性液滴之间的良好区分（图3A）。对数-对数最佳拟合线显示，预期的载体浓度（通过Qubit测量）与测得的载体浓度（ddPCR测量）之间具有良好的线性关系，平均R2值为0.9981（三次重复分别为0.9999、0.9945和0.9999）（图3B）。这些结果表明，当前设计在定量WPRE序列时能够达到高特异性和准确性。

在每次ddPCR运行中，使用无核酸酶的水作为NTC，从而确定WPRE检测的LoB为反应混合物中的1.3拷贝/mL。随后，计算出LLoD为反应混合物中的2.3拷贝/mL，而LLoQ则设定为反应混合物中的6.4拷贝/mL。

图3 敏感性和准确性评估。

VCN定量与实验间重复性

通过使用含有WPRE序列的逆转录病毒载体，对来自两名不同供体生成的CAR20-T细胞产品进行了检测重复性和可再现性的评估，分别标记为CAR-1和CAR-2。通过流式细胞术测量的CAR转导效率在两种CAR-T细胞产品之间有所不同，其中CAR-1为52.3%，CAR-2为96.7%。每份样本的基因组DNA被分离，并与固定量的非模板背景DNA（来源于与制备CAR-T细胞产品相同供体的PBMCs中提取的人基因组DNA）进行两倍系列稀释（图2A）。加入基因组DNA是为了排除基质干扰并模拟测试样本中低拷贝数的情况。值得注意的是，所有稀释样本中的WPRE序列浓度值均超过了LLoQ（6.4拷贝/mL）（表S1），这表明所有样本孔的数值是可靠的。此外，在两种CAR-T细胞产品中，测得的平均病毒拷贝数（VCNbulk）与预期转导效率之间表现出强烈的线性关系（CAR-1的R2=0.9961，CAR-2的R2=0.9983）（图2B）。这些数据证明了所建立的ddPCR检测方法的准确性，因为样本中CAR-T细胞基因组DNA的减少会导致平均VCN成比例下降。

为评估实验间重复性，稀释后的样本在三个不同时间点、每周一次通过 ddPCR 进行分析。所有测试均由同一位操作员使用相同的仪器完成。对不同时点测得的 VCN 进行双向方差分析，结果显示无统计学显著差异（P > 0.05）（图 2C）。实验间的变异系数（CV%）始终小于 6%（图 2C），表明该检测方法具有很高的重复性。稀释样本的 VCNbulk 平均值、标准差以及 CV% 值见表 S2。这些结果证明了使用 ddPCR 测定携带同时编码 WPRE 目标序列的载体转导的 CAR-T 细胞产品平均 VCN 的可行性，并且具有高度重复性。

表S1 稀释样本中WPRE基因的绝对拷贝数

表S2 批间分析

转导细胞的VCN精确定量

该检测方法的一个显著局限在于它依赖于包含转导和未转导细胞的总体细胞群中的平均值。这在转导效率低的CAR-T细胞产品中尤其成问题，因为转导细胞的VCN可能被显著低估。为了提高VCN作为临床细胞产品安全指标的可靠性和代表性，对转导细胞内的VCN进行特异性定量至关重要。

尝试根据泊松分布统计学推算的理论转导效率来调整总体VCN，这在实际转导率未知时提供了最佳估算。通过从6个CAR20-T细胞产品中分选出CAR阳性(CARpos)和CAR阴性(CARneg)细胞（图4A），评估了这种方法的可行性和准确性，这些产品的转导效率和平均VCN各不相同。在分析中，发现CARneg细胞群始终显示出每细胞不足一份的VCN（图4B和表1）。这一结果与分选过程完全吻合，证实了这些细胞群中的低转导或未转导状态。相比之下，分选出的CARpos细胞表现出显著高于相同样本总体平均VCN的VCN值（VCN CARpos对比VCNbulk），尤其是在总体VCN较低的情况下。例如，样本S4的比较结果显示VCN水平为0.57对比1.57，这表明仅依赖平均VCN无法准确代表转导细胞群。

然而，调整后的VCN值（记为VCNadj）更能准确反映转导细胞的VCN（图4C和表1），因为这些数值更接近VCN CARpos，尤其是在总体VCN较低的情况下。还估算了在每个给定VCN水平下的细胞百分比，并评估了VCN小于或等于某个给定值的细胞累积分布情况（图4D）。结果表明，当VCNadj升高时，相当一部分细胞表现出更高的VCN水平。例如，在样本S1和S3中，VCNadj分别为8.47和9，约一半的细胞VCN超过9。相反，在VCNadj较低（<5）的样本中，超过90%的细胞VCN<5。

值得注意的是，计算得出的未转导细胞（VCN为零）的理论百分比始终低于通过流式细胞术分析获得的数值，这表明某些细胞可能未达到可检测水平的CAR表达，但仍含有病毒载体。这也与观察结果一致，即即使在分选的CARneg细胞群中未检测到CAR表达，仍能检测到病毒载体的存在。

总之，研究结果强有力地支持了将VCNadj作为细胞产品可靠指标的可行性，同时结合特定VCN水平的细胞比例及其累积分布进行评估。这种全面的方法不仅提高了VCN报告的准确性，还为CAR-T细胞产品的特性提供了更深入的认识。

图4 CAR-T细胞产品中的调整后VCN。

表1 bulk和分选细胞中的VCN

总结

qPCR是测定VCN的常用方法。基于ddPCR的技术已出现，提供了更高的灵敏度和准确性。此外，与基于qPCR的方法相比，ddPCR方法每反应所需的输入DNA更少（仅需20ng DNA）。在这里，建立并验证了一种用于测定CAR-T和TCR-T细胞产品中VCN的ddPCR方法。该方法旨在检测常用于病毒载体设计中的WPRE序列，因此适用于病毒载体工程化CAR-T细胞产品的VCN定量分析。该方法表现出优异的准确性和灵敏度，在不同时间点的CV值低于6%，表明其具有高实验间精密度。因此，该方法适用于如CAR-T等临床T细胞产品的VCN定量。

在临床试验期间，监测CAR-T细胞的动力学是另一个重要方面，因为CAR-T细胞在体内的扩增和长期功能持续性与治疗的疗效和毒性相关。预计此检测方法也可用于治疗后患者体内CAR-T细胞的监测，以追踪药代动力学。然而，在此背景下应用之前，需要进行额外的验证工作。

这里，选择使用一个预先建立的检测方法来定量参考基因（TERT），而未进行验证。根据临床背景的不同，TERT的拷贝数在癌细胞中可能会发生变化，在泛癌分析中约有2%的病例存在TERT扩增。然而，认为健康T细胞中TERT扩增的风险较低，因为最终的CAR-/TCR-T细胞治疗产品会应用严格的标准以排除癌细胞。该方法专门用于定量γ-逆转录病毒载体工程化细胞产品中的WPRE基因。理论上，此方法原理也可应用于慢病毒载体转导的细胞产品，以及缺乏WPRE基因插入的细胞产品。在后一种情况下，需要筛选和验证新的引物探针组合。

对整个测试细胞群体的平均值进行VCN量化可能会低估转导细胞内的实际VCN。确定实际VCN的一种方法是对分选的CAR表达细胞进行分析。然而，这增加了复杂性和工作量。更重要的是，并非所有转导（含病毒基因组）的细胞都能以可检测和分选的水平表达CAR分子。为克服这些挑战，建立了一种简单的方法，通过用泊松统计计算的理论转导效率对VCNbulk进行校正，从而近似转导细胞中的实际VCN。该计算也存在其自身的局限性，因为它完全基于概率理论以及所有数学和生物学假设，包括（i）每次转导都是随机且独立的；（ii）所有细胞对转导的敏感性相同；（iii）无论是否发生转导或插入拷贝数如何，所有细胞都以相似的速度生长。重要的是，由于在CARneg群体中也可能存在含病毒载体的细胞，因此也通过实验验证了VCN的调整优化（VCNadj）在生物学上的合理性，因为VCNadj值落在VCNbulk和VCN CARpos之间。根据流式细胞术分析，未转导细胞的平均VCN<1，证实这些细胞中几乎没有转基因整合。

需要注意的是，该检测方法评估的是群体水平的VCN，因此提供的是一个平均值，这意味着一定比例的细胞其VCN会高于平均值。有研究者研究了单细胞水平的VCN分布，并证明单细胞VCN的分布遵循群体VCN的平均值。然而，单细胞VCN分析流程需要更多的资源，且工作量更大，因此不太适合用于药物产品上的常规测量。实际上，采用泊松统计学方法，展示了在每个给定VCN下细胞的理论概率分布及其累积分布。这些信息与平均VCN值一样重要，对于理解细胞产品内部的整体VCN分布具有关键意义。

总之，在此介绍了一种快速且精确的VCN量化方法。通过对整体细胞群体进行分析，并通过归一化优化数值（VCNadj），在转导细胞中，例如CAR-T细胞药物产品中，这种方法在VCN的近似计算上既充分又具有成本效益，在准确性和实用性之间找到了平衡。

Ma, J. et al. An adjusted droplet digital PCR assay for quantification of vector copy number in CAR-T cell and TCR-T cell products. Immuno-Oncology and Technology, Volume 25, 101031

Santeramo, I. et al. Vector copy distribution at a single-cell level enhances analytical characterization of gene-modified cell therapies. Mol Ther Methods Clin Dev. 2020; 17:944-956

Fehse, B. et al. Digital PCR assays for precise quantification of CD19-CAR-T cells after treatment with axicabtagene ciloleucel. Mol Ther Methods Clin Dev. 2020; 16:172-178