GPC3在肝癌治疗中的应用进展

肝癌是威胁人类健康重大疾病之一，发病率及病死率在我国均居第4位［1］。目前公认的治疗方案是以手术切除为核心的多学科综合治疗，近期疗效虽有提高，但远期疗效仍不理想，因此探究治疗肝癌更加有效的新策略是目前国内外研究热点［2］。自1996年磷脂酰肌醇蛋白聚糖(Gypican，GPC)3被发现以来［3］，其在肝癌中的作用机制以及对肝癌的诊治价值已引起国内外学者的广泛关注。

GPC3是一种细胞膜表面的硫酸乙酰肝素（HS）糖蛋白，是肝癌特异性相关抗原。它是由蛋白质、脂质和糖三者共价连接的复杂糖复合物, 通过糖基磷脂酰肌醇锚定于细胞膜表面。GPC3基因定位于人染色体Xq26, 基因组结构全长大约900 kb，具有中央球状结构空间、C′端糖胺聚糖侧链连接位点等结构特点。其HS基与生长因子及其受体、细胞外基质蛋白和黏附分子等相互作用, 参与调节细胞增殖、分化、黏附和迁移等。它主要通过Wnts信号途径发挥作用，通过自分泌和旁分泌的方式来激活经典Wnt信号途径使Wnt基因高表达, 而Wnt基因的表达产物能够促进多种肿瘤组织生长。GPC3表达特点是在肝癌组织中过表达，而在正常肝组织不表达或低表达，基于GPC3特有的结构和功能特点, 将其作为肝癌的治疗靶点，有可能成为治疗肝癌的一把利剑。本文就GPC3在肝癌治疗中的应用进展作一概述。

1  GPC3基因治疗对肝肿瘤增殖的影响

目前已经有研究［4-5］显示，通过GPC3 microRNA(miRNA)、小发卡RNA(shRNA)和小干扰RNA(siRNA)介导的基因治疗肝癌取得良好的疗效。通过敲除肝癌细胞中GPC3基因，Wnt信号通路发生改变，细胞质中β-catenin及细胞周期蛋白D1表达水平升高，促进Bax/Bcl-2/细胞色素c/caspase-3通路功能障碍，抑制肝癌细胞增殖及诱导凋亡，并且逆转肿瘤细胞对化疗药耐药性［6-7］。由于肝癌细胞特殊的生物学行为干预了GPC3基因正常转录，因此杨婕等［8］构建4种GPC3-shRNA质粒转染肝癌HepG2细胞，以Real-time PCR、Western Blot法观察GPC3基因及蛋白表达水平。结果显示4种转染质粒中shRNA1转染HepG2细胞效率＞85%，在mRNA水平的沉默效率为89.3%，GPC3蛋白表达显著抑制。特异性shRNA干预GPC3转录可抑制肝癌细胞增殖、迁移运动和侵袭能力，并诱导肝癌细胞凋亡，与抗肿瘤药物协同抑制癌细胞增殖，提示GPC3基因是潜在治疗肝癌的新靶点［8-9］。

另有学者［10］发现将GPC3基因转染的树突状细胞（DC）与细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）共同培养抗肿瘤，可引起特异性免疫反应。DC-GPC3显著促进自体CIK分化，以及抗肿瘤细胞因子IFNγ分泌。DC-GPC3-CIK能显著抑制肿瘤生长并增强杀伤肿瘤活性。

过度表达的GPC3通过诱导细胞凋亡以抑制肝癌细胞增殖。GPC3基因重组转染在Huh7和SK-Hep-1两个肝癌细胞系，应用Annexin V/PI双染色法证实GPC3过度表达，通过负调节IGF2和FGF2途径，有效地诱导细胞凋亡以抑制肝癌细胞增殖和侵袭［11］。经过负向调节使GPC3过度表达，逆向诱导细胞凋亡来抑制肝癌细胞增殖，成为一种新的治疗思路。

2  多肽GPC3瘤苗及肝癌微创介入诱导机体GPC3特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）免疫反应

GPC3多肽疫苗通过激活患者自身免疫反应，抑制肿瘤生长、扩散和复发。Sawada等［12］应用多肽疫苗治疗33例晚期肝癌患者，第1、15、29天皮下注射多肽GPC3瘤苗递增剂量依次为0.3、1.0、3.0 mg，结果证实GPC3多肽疫苗具有良好的安全性和耐受性。接受GPC3多肽疫苗治疗的肝癌患者平均中位生存期为9.0个月。根据实体瘤的疗效评价标准，4例患者获得完全缓解、1例部分缓解、19例病情稳定在2个月内。获得部分缓解患者锁骨上淋巴结转移病灶和肝内2个病灶明显缩小，并且胸骨转移病灶在第3次疫苗注射后1个月出现液化坏死。这些患者均诱导GPC3特异性CTL反应，应用酶联免疫斑点技术法观察疫苗注射后CTL频数变化，发现CTL频数≥50(n=15)，中位生存时间12.2个月，CTL频数＜50(n=18)，中位生存时间8.5个月，可见GPC3特异性CTL频数越多，中位生存时间越长并且总生存期也越长，特异性CTL频数可以作为GPC3多肽疫苗治疗后肝癌患者总生存期的预测指标。随后该团队临床研究又发现GPC3疫苗治疗肝癌诱导CD8+T淋巴细胞浸润瘤体和瘤周的病理学证据。1例经肝动脉化疗栓塞术（TACE）治疗失败、索拉非尼治疗无效的巴塞罗那分期C期肝癌患者，间隔25 d接受2次GPC3多肽瘤苗皮下注射治疗，注射后患者出现发热、肝损伤和全身乏力等表现，第二次注射后症状显著。第二次注射后第10天增强CT显示，肝脏肿瘤显著坏死、缩小，但与治疗前相比，右心房癌栓明显增大，30 d后该患者死于循环衰竭。2周后尸检发现CD8+T淋巴细胞浸润残留癌灶和坏死肿瘤与正常肝组织交接区域，而瘤周正常肝组织中则未见CD8+T淋巴细胞。右心房癌栓却只有微少量CD8+T淋巴细胞浸润［13］。该病例通过免疫组化方法证实大量的浸润型CD8+T淋巴细胞进入残存的肿瘤组织中，但是还不能证实，这些T淋巴细胞能够对表达GPC3的肝癌细胞具有细胞毒作用。所以该研究团队从已经完成的I期临床研究中，应用HLA-A2-限制性GPC3多肽疫苗治疗人类白细胞抗原（HLA）-A*02:07阳性肝癌，获取部分缓解疗效的患者外周血单个核细胞，从中培养出GPC3肽特异性CTL克隆，进一步体外细胞实验发现，克隆的CTL只对表达内源性GPC3和HLA-A*02:07阳性的肿瘤细胞具有良好的亲和力，并分泌IFNγ发挥细胞毒性作用［14］。上述研究初步形成GPC3多肽疫苗皮下注射能够诱导机体产生GPC3特异性CTL治疗肝癌的较完整的证据链条。

另外有学者［15］证实，肝癌微创介入术后坏死的肿瘤细胞或暴露的肿瘤抗原物质，同样能够诱导机体的特异性抗肿瘤免疫反应。Nobuoka等［15］将27例肝癌患者平均分为3组进行射频消融（RFA）、手术切除和TACE治疗。在3种方法治疗后循环血中GPC3特异性CTL增加情况：RFA组5例，TACE组4例，手术切除组1例。RFA术后GPC3-CTL数量增加明显高于手术切除。同样在带瘤小鼠模型中，RFA术后GPC3-CTL频率也明显高于手术切除。并且通过酶联免疫斑点技术方法证实，RFA及TACE术后显色斑点个数及大小均明显大于术前，证实RFA及TACE术后GPC3表达增加且诱导特异性的CTL杀伤肿瘤细胞。通过外源或内源性方法激活肿瘤相关抗原的特异性T淋巴细胞反应，这对于未来肝癌免疫治疗进展具有重要意义。

3  GPC3抗体治疗肝癌的研究进展

GPC3抗体是目前肝癌免疫治疗领域引人关注的研究方向，包括GC33、HN3、py7、HS20等。GC33是目前从功能、基础研究到临床研究较为深入的GPC3抗体，并且已经注册了临床研究(http://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00746317)。

GC33是一种针对GPC3新型重组人单克隆抗体，与GPC3有很高的亲和力。GC33依靠抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用，通过识别GPC3外功能区来发挥抗肿瘤活性［16］。Ishiguro等［17］在裸鼠的肝癌实验中发现，GC33抗体能够显著降低表达GPC3的肝癌鼠血清中GPC3和AFP水平,对表达GPC3的肝癌细胞和移植于鼠体内的Hun7人肝癌细胞具有杀伤作用。2012年，美国哈佛大学研究人员进行一项GC33抗体治疗肝细胞癌（HCC）的一期临床研究［18］，入组20例巴塞罗那分期C期肝癌患者采用静脉滴注方法，GC33抗体递增剂量（2.5、5、10、20 mg/kg，1次/周），其中15例患者至少完成4次治疗。研究结果显示，在GPC3高表达组中位肿瘤进展时间为26周，AFP较治疗前降低。GPC3低表达或者无表达组，中位肿瘤进展时间仅为7.1周。26周以内病情稳定患者的共同特点是血清GPC3高表达，提示GPC3高表达的HCC患者接受GC33抗体治疗可能会取得更好疗效。大部分患者在第一次治疗后出现一级或者二级不良事件，无四级或五级不良事件发生，表明GC33抗体具有较好的安全性。随后，日本学者［19］在此基础上，以13例原发性肝癌患者作为研究对象，观察应用GC33抗体的临床疗效。研究设计了“3+3”剂量爬坡实验，以确定GC33抗体静脉途径应用的最大耐受剂量。剂量选择标准是依据GC33抗体治疗肿瘤移植小鼠的前期研究结果［17］，实验分为3个剂量组，5 mg/kg 4例，10 mg/kg 3例，20 mg/kg 6例，持续静脉滴注，30~90 min，1次/周。研究结果：13例患者中，7例患者病情稳定，3例稳定时间超过5个月；69%（9/13）患者血清AFP下降。无严重不良事件发生，无因不良事件致死或者停止治疗病例，初步研究结果证实，静脉滴注GC33治疗HCC具有良好的安全性和疗效，耐受剂量可达每周20 mg/kg。

HN3抗体主要是识别功能表位和抑制Wnt信号通路。也有文献［20］报道HN3的基本作用机制可能是阻滞肝癌细胞周期的G1期相关蛋白的信号。与GC33相比HN3有3个特性;(1)能直接抑制肝癌细胞的增殖；(2)是一种单域抗体；(3)是完全的人类蛋白。yp7抗体识别C-末端表位但不抑制Wnt信号。这两者都是融合在假单胞菌属外毒素A的一个片段来产生免疫抗体的［21］。ir700-HN3抗体是一个重链可变区抗体，与细胞表面的GPC3分子有很好亲和力。有学者［22］通过应用放射性同位素111In、125I标记的ir700-HN3抗体，通过ir700-HN3抗体在体内肿瘤分布情况来估测抗体进入肿瘤的数量以及到达肿瘤的范围，从而评估应用该抗体治疗肝肿瘤的疗效。另外，该学者通过比较ir700-HN3抗体与yp7抗体，证实重链HN3抗体相比传统yp7抗体表现出更多的优势特性，为抗肝癌的分子靶向抗体设计了一个新的平台。

此外,人类单克隆GPC3的HS靶向抗体通过抑制肝细胞生长因子介导肝癌细胞的迁移和运动来发挥治疗肝癌的作用。HS20抗体针对GPC3的HS链，抑制Wnt3a/β-连环蛋白的活化［23］，并扰乱Wnt3a和GPC3的作用，阻断Wnt a/b-catenin信号通路，而且HS20抗体在小鼠体内没有显示出毒性，体现出良好的安全性［24］。

目前尚无研究证实，肝癌患者经过GPC3抗体治疗后肿瘤内GPC3表达情况是否改变。有专家［25］认为，GPC3抗体治疗肝癌后，GPC3表达下降，会降低抗体药物的疗效，但机制需要进一步研究。

4  GPC3作为靶向载体治疗肝癌的其他应用

GPC3靶向光免疫治疗联合纳米白蛋白结合型紫杉醇是一种治疗肝癌的有效方法。Hanaoka等［26］将IR700-YP7标记GPC3抗体联合纳米白蛋白结合型紫杉醇静脉注射到肝癌小鼠体内，发挥GPC3抗体特异性肿瘤导向作用，靶向引导IR700-YP7标记的GPC3抗体沉积在A431/G1细胞肿瘤内，而后应用波长为960±20 mm红外光照射肿瘤细胞，发现肿瘤细胞死亡，肿瘤生长受到抑制。这一研究说明GPC3靶向光免疫治疗有着良好的应用前景。

肝癌细胞中miRNA-520c-3p与GPC3蛋白表达水平呈负相关，推测miRNA-520c-3p表达增加能够降低GPC3蛋白表达水平。通过将miRNA-520c-3p转染到HCC患者体内，降低GPC3蛋白水平来抑制肝癌细胞增殖及侵袭［27］。

GPC3可诱导Huh7肝癌细胞增殖。YAP（Yes-associated protein）在肝癌中过表达，已被确定为Hippo信号通路(调节癌细胞增殖和凋亡)的关键效应分子，并与GPC3在肝癌发展过程中起到协同作用［28］。膜联蛋白-V-FLUOS凋亡实验［29］表明，重组人YAP-1有效地阻止GPC3引发的Huh7细胞增殖，从而抑制肝癌的发生。Magistri等［30］采用3种人肝癌细胞系（Hep3B、PLC／PRF／5和SK-HEP-1）和1个Hhresponsive肝星状细胞（HSC）系（LX-2），开展了2个HCC-to-HSC旁分泌的体外模式，包括共同培养和条件培养模式，证实了3个肝癌细胞系具有降低HSC的能力。GPC3通过Hedgehog信号转导通路调节HSC。应用重组GPC3试剂降低了LX-2的活性，抑制了Hedgehog的靶点基因，进而抑制了肝癌细胞系降低HSC能力的作用。另外重组GPC3试剂作为Hh基因调控员，促进了Hh基因对HSC能力的提升作用，从而抑制肿瘤增殖。总之, 以GPC3为靶向载体治疗肝癌已出现各种方式和方法, 相信不久以GPC3作为肝癌治疗靶点的研究将会取得重大进展。

5  展望

GPC3在肝癌发生和发展中作用机制的研究已成为国内外研究热点。GPC3在肝癌诊断方面亦有其独特的价值［31-32］。GPC3瘤苗、GPC3抗体、GPC3基因及靶向等治疗手段是治疗肝癌的诸多利剑。随着对GPC3功能的深入研究及开发GPC3在肝癌诊疗中的新应用, 必将大大推动肝癌治疗的发展, 造福于广大肝癌患者。

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引证本文：任志忠,  张跃伟. 磷脂酰肌醇蛋白聚糖在肝癌治疗中的应用进展[J]. 临床肝胆病杂志, 2017, 33(7): 1369-1372.本文编辑：林姣 公众号编辑： 邢翔宇