【衡道丨RET】精准聚焦——非小细胞肺癌融合基因的诊断

 

NSCLC与基因融合

 

非小细胞肺癌（NSCLC）是最常见的肺癌亚型，约占肺癌的85%，目前NSCLC的驱动基因较为明确，其驱动基因的变异形式主要包括基因突变、拷贝数变异、基因融合等[1]。

融合基因由染色体结构重排引起，造成两个或多个不同基因的编码区首尾相连，置于同一套调控序列（包括启动子、增强子、核糖体结合序列、终止子等）控制之下，构成新的嵌合基因[2]。基因融合是肿瘤发生发展的常见机制之一，有研究表明在多达17％的实体瘤中鉴定出至少一种基因融合体，基因融合会导致激酶持续性激活从而引发癌症，此外，基因融合也是目前部分靶向治疗获得性耐药的机制之一[3]。NSCLC中融合基因有经典的ALK、ROS1，还包括一些逐渐被重视的融合基因如RET、NTRK1/2/3、NRG1、FGFR1/2/3等，此外，研究表明EGFR、BRAF、MET及ERBB2等常见驱动基因也会发生基因融合变异[4]。携带基因融合变异的NSCLC统称融合变异型NSCLC，约占NSCLC的10%-15%左右，近年来越来越受到临床关注。

 

 

基因融合的常用检测技术

 

随着ALK，ROS1等融合基因的靶向药物获批进入临床治疗， NSCLC的融合基因检测已成为肺癌常规诊疗中的一部分。合理选择融合基因诊断方法对于有效预测患者获益具有非常重大的意义。目前临床常用的融合基因检测方法包括荧光原位杂交（FISH）、免疫组织化学（IHC）、逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和二代测序（NGS）等[5-13]。

IHC技术：

通过特异性单克隆抗体检测融合蛋白表达情况。IHC方法本身具有耗时短，成本低，且已实现全自动操作等优点，可作为一些融合基因如ALK融合及NTRK融合等的筛查手段。但在缺乏特异性强的检测抗体时，IHC的假阳性率和假阴性率均较高（如目前RET融合的IHC检测）。对于未经获批的IHC检测方法诊断的阳性结果，建议进一步使用其他检测手段进行验证。

FISH技术：

该技术通过荧光标记的DNA探针来鉴别感兴趣的核苷酸序列，可以检测拷贝数，扩增和染色体结构改变（例如基因重排）。融合变异型肺癌中FISH不仅可以检测已知融合，还可检测未知融合，且由于其结果的可靠性及稳定性，仍然是目前检验其他检测技术准确性的重要手段，如ALK断裂探针被认为是ALK融合检测的金标准。

但该技术本身存在一定的局限性，如

（1）肿瘤组织的异质性可能影响FISH检测的结果偏差；

（2）某些罕见或未知的断裂与融合位点间距可能小于FISH可判读的最小阈值，从而导致假阴性的产生；

（3）整个检测过程耗时较长，成本高，对操作和判读技术要求较高，诊断医师必须经过严格的FISH操作和结果判读培训，因此该技术不适用于大规模筛查性诊断。

RT-PCR技术：

RT-PCR技术通过将RNA在逆转录酶和特异性引物作用下逆转录成cDNA，然后设计探针对基因融合位点进行检测，从而判断基因是否发生融合。RT-PCR技术的特点在于周期短、敏感性高、操作和结果判读相对简单，因此广泛应用于融合基因的筛选研究中，也是目前基因融合检测广泛应用的手段之一。该技术的主要局限性为只能检测已知的基因融合类型，不能检测未知的融合类型，因此存在假阴性的可能性。此外，RT-PCR对RNA模板的质量要求高，对于福尔马林处理过的样本可能由于RNA降解导致假阴性。

二代测序（NGS）技术：

NGS 优势在于可有效检出已知和未知的融合基因类型，可弥补常规检测方法存在的漏检、或不能明确融合伴侣基因等不足。按照检测模板的不同，可以分为DNA-based NGS和RNA-based NGS。由于基因融合断裂位点多在内含子，且断裂位置不确定，因此DNA-based NGS检测基因融合理论上需要全面覆盖基因的内含子和外显子区域，如果未能完全覆盖则可能会造成假阴性结果。RNA-based NGS则有望弥补这一不足，RNA-based NGS检测基因融合的探针只需要覆盖外显子，探针设计难度较DNA更低，还可以检出转录水平剪切形成的融合基因，但受到RNA质量的影响，不能同时对基因突变进行检测。

美国国家综合癌症网络（NCCN）NSCLC指南提出对于在广泛组合的检测中未发现驱动基因的患者（尤其是非吸烟者），考虑采用RNA-based NGS检测，以最大程度地发现融合事件。基于ctDNA的NGS融合基因检测研究数据也在不断丰富，血液中ctDNA含量因肿瘤不同而差异较大，有研究提示基于ctDNA的NGS融合基因检测敏感性低于组织检测。ctDNA可作为组织样本不可及患者的融合基因检测补充选择，但目前还缺乏相应的检测标准和规范。

 

NSCLC中常见的融合基因及诊断

 

ALK

间变性淋巴瘤激酶（ALK）最早作为间变性大细胞淋巴瘤的一个亚型被发现，并因此得名。伴有ALK基因融合的肺癌是NSCLC一个重要的临床亚型。ALK基因融合在我国非小细胞肺癌中的发生 率 约 5.6%，其 中 腺 癌 的 发 生 率 为 6.6%~9.6%，并与KRAS和EGFR突变相排斥。

近年来ALK 抑制剂的研发和临床应用取得 了 较 大 的 突 破 ，已经成为NSCLC中ALK重排患者重要的治疗手段，包 括 一 代［如 克 唑 替 尼（Crizotinib）］、二代［如阿来替尼（Alectinib）、塞瑞替尼（Ceritinib）、Brigatinib］乃 至 三 代 ALK 抑 制 剂（Lorlatinib），可明显提高ALK 阳性晚期NSCLC患者的客观缓解率并延长无进展生存期[7]。随着越来越多的 ALK 基因罕见融合亚型的发现，以及 ALK 抑制剂获得性耐药机制的阐明，临床对 ALK 基因检测提出了更多的需求。根据患者需要，选择准确、快速、恰当的 ALK 检测方法，筛选出适用 ALK 抑制剂的目标人群具有重要临床意义。

ALK 基因重排导致 ALK 融合基因的表达这一分子生物学基础决定了检测ALK 基因融合可以在多个分子水平上进行，2019年发布的《中国非小细胞肺癌ALK检测临床实践专家共识》中提出已获批的Ventana-D5F3 IHC、FISH、RT-PCR、NGS 检测方法均可用于 ALK 基因融合诊断[14]。

ROS1

ROS1融合基因是一种独特的受体酪氨酸激酶，与ALK同属胰岛素样受体酪氨酸激酶超家族成员，二者氨基酸序列上具有近49%的相似性，在激酶催化区的ATP结合位点同源性高达79%，且临床特征上也非常相似。ROS1融合基因在NSCLC中发生率约为1%-2%，和ALK相似，常见于年轻，不吸烟的腺癌患者。2020年中国临床肿瘤学会（CSCO）NSCLC指南中指出ROS1融合是NSCLC的另一种特定分子亚型，已有多个研究表明晚期含有ROS1融合的NSCLC患者接受克唑替尼治疗有效[7]。

ROS1融合的检测方法包括FISH法，RT-PCR法，IHC法及NGS法。FISH方法为NCCN指南推荐的ROS1融合基因检测方法，价格较高，操作规范要求高，目前还没有FDA获批的FISH检测；RT-PCR对标本质量要求高，需专用的试剂盒进行检测，目前国内已有多个试剂盒获得NMPA批准；IHC简便易行，但阳性标准不统一，有一定的假阳性。《中国ROS1阳性非小细胞肺癌诊断病理专家共识》指出结合靶向药物临床试验数据，推荐使用经过验证的技术进行ROS1融合基因的检测，首选国家药品监督管理局（NMPA）批准的RT-PCR检测，其次是经过验证的FISH检测平台，ROS1的IHC结果不能直接指导临床用药，需采用其他技术进行确认[15]。

RET

RET基因融合在NSCLC中发生率为1%-2%，我国每年新增NSCLC-RET阳性人群约1.1万人。RET基因最常见的断裂位点位于内含子11，部分融合断点位于内含子7和内含子10，至今已发现至少50余种RET融合变体，其中以KIF5B-RET，CCDC6-RET最为常见。RET融合通常与EGFR，ROS1，BRAF，METex14跳跃和ALK变异相排斥，且RET融合的患者对免疫治疗获益有限[16]。两款高选择性RET抑制剂selpercatinib和普拉替尼（pralsetinib）因在晚期RET融合阳性NSCLC中显示出良好的抗肿瘤活性和安全性，已获得美国FDA批准用于转移性RET融合阳性非小细胞肺癌，其中普拉替尼胶囊已获得NMPA已正式受理的上市申请并纳入优先评审，用于治疗经含铂类化疗的RET融合阳性的NSCLC患者[17]。

 

RET融合检测标准和推荐方法还无定论， NCCN指南推荐包括RET融合基因在内的更广泛的分子谱检测，以鉴别有可及药物的罕见驱动突变，或就临床试验的可能性向患者提供适当的建议[5]。CSCO NSCLC诊疗指南（2020）推荐通过NGS确定包括RET融合在内的具有临床意义的目标靶点（2B类证据）[7]。另外，RET融合也是EGFR TKI获得性耐药机制之一，对于EGFR-TKI耐药患者，也建议再次进行RET基因检测[18,19]。目前，可用于RET基因检测的方法包括RT-PCR、FISH、NGS等，但每种方法都具有优缺点，有条件的实验室可以在检测时进行相互补充和验证。目前国内已有多个获批的包含RET基因融合变异的NGS和RT-PCR检测试剂盒。

 

 

NTRK

NTRK 基因融合可见于多种实体肿瘤，在一些罕见肿瘤中频繁发生，在肺癌、乳腺癌、甲状腺癌、结直肠癌等常见肿瘤中也占有一定比例。针对这一靶点的药物获批，给罹患不同癌症的患者都带来了新的希望，各个癌种的权威指南均提示，只要检出肿瘤携带NTRK 基因融合，就可以考虑使用相应的靶向药物治疗。NTRK 基因融合在NSCLC 中发生率仅为0.2%，但在无常见驱动基因突变的NSCLC 中发生率可增至3%[20]。

2019 年第 3 版NCCN NSCLC 指南开始新增NTRK 基因融合为肺癌靶向用药相关基因检测，目前可选择的方法有IHC、FISH、RT-PCR和NGS。由于NTRK在多种肿瘤中都存在融合，且发生频率差异较大，在选择NTRK 基因融合检测方式时，需考虑时间、技术、成本等多种因素[5]。欧洲肿瘤内科学会（ESMO）指南提出了“两步方案”的检测方法。在NTRK 基因融合发生率低的肿瘤中，可以选择pan-TRK IHC 这种快捷可靠的筛选方法。当前期检测显示 TRK 蛋白表达阳性的情况下，推荐用 NGS 证实是否存在特定的基因改变。对于低NTRK 基因融合发生率和低 TRK 蛋白表达的NSCLC来说，未常规行分子检测的患者，推荐先行 pan- TRK IHC 进行评估；已行分子检测且常见靶点如 EGFR、ALK、ROS1 等均为阴性的患者，首先推荐包含 NTRK 基因融合的 NGS。当怀疑存在特定的 NTRK 基因融合类型时，可考虑选择FISH 或RT-PCR 检测[21]。

 

总结

 

染色体结构重排可导致基因之间编码或调控DNA序列的交换从而引起基因融合。融合类型与肿瘤表型之间的紧密联系使融合基因成为理想的诊断目标，不仅使肿瘤实体得以细分，还提供了风险分层的重要信息。当前，越来越多融合基因编码的嵌合蛋白成为肿瘤的治疗靶标，如RET融合， NRG1融合[22]以及FGFR融合[23]等新兴的治疗靶点为肺癌患者治疗带来了新的希望。融合基因的诊断策略将随着临床研究的不断推进而随之调整，基因融合的诊断还需要更多的研究数据来帮助患者和医生选择合适的检测方法。