免疫治疗丨血液TMB（bTMB）可有效预测免疫治疗疗效且成功检测率高于组织！

" 肿瘤突变负荷（  TMB  ）已被证明可以预测NSCLC患者接受免疫检查点抑制剂治疗的生存获益情况。使用血液检测bTMB相较于使用组织检测tTMB更具有临床实用优势，尤其是对于晚期已经发生转移的肿瘤患者。此外，血液bTMB的成功检测率（  81%  ）大大高于组织tTMB的成功检测率（  63%  ）！ "

临床诊疗中，组织活检是肿瘤诊断和治疗的金标准，但其侵入性意味着组织活检并不总是可行的，这主要取决于肿瘤的位置和患者的表现状态，特别是晚期肿瘤患者。

即使可以进行组织穿刺活检，通常也会因临床的诸多检测导致约30%的患者无法再获取足够的组织进行标准的组织NGS检测。此外，肿瘤组织活检可能局限于肿瘤的特定区域，不能准确的反映整个肿瘤的突变全景，特别是转移情况下的空间和时间异质性。

利用血液作为标本来源检测获取肿瘤的相关信息，如血液TMB（bTMB），是一种简单且非侵入性的组织活检替代方法，我们称之为液体活检，它具有周转时间快，患者依从性好，特异性好，异质性低，可反复取材等优势。

作为一种新兴免疫治疗临床获益的预测生物标志物，bTMB可能比tTMB更具优势。先前的OAK，POPLAR，IMpower110及B-F1RST研究证实，bTMB≥16 mut/Mb的NSCLC患者接受阿替利珠单抗的治疗效果更好；1,2,3 另一项较小的NSCLC研究（n=66）亦发现，帕博利珠单抗一线治疗bTMB≥16mut/Mb的NSCLC患者，PFS和OS获益更高。4

2020年12月22日，《Clin Cancer Res》发表了MYSTIC的III期bTMB研究结果，此研究描述了一种新的bTMB算法，该算法在MYSTIC的III期探索性分析中显示了潜在的临床应用价值，bTMB≥20mut/Mb的NSCLC患者（无EGFR和ALK变异）一线接受度伐利尤单抗 + Tremelimumab（ CTLA-4单抗 ）相较于铂基化疗效果更好。5

此次研究，共招募1,118例 EGFR-/ALK- IV期NSCLC患者，无论其PD-L1表达水平如何，按1:1:1随机分配给度伐利尤单抗单药组（n=374），度伐利尤单抗+tremelimumab组（n=372）及铂基化疗组（n=372）。

▲ MYSTIC研究设计

tTMB检测分析：使用FMI的F1CDx 315基因（现324基因）进行组织检测，编码区为 1.1Mb，LoD为 0.5%，算法采用先前公开算法；

bTMB检测分析：使用GH的 GuardantOMNI 500基因（RUO）进行血液检测，panel大小为 2.145Mb（编码区为 1.0Mb），LoD为 0.3%；bTMB的计算包括同义和非同义 SNVs 和 indels，胚系突变被过滤掉（胚系过滤采用胚系变异数据库和β-二项式算法），此外，驱动基因和耐药基因突变及克隆性造血突变均被排除在外。另外考虑到血浆样本中的突变检测受肿瘤脱落量的影响，脱落量越低，无法检测到突变的几率就越高，以及覆盖的深度，突变计数的算法调整可纠正这些生物和技术样本特征（计算校正，通过最大VAF评估肿瘤脱落水平）。

中位血浆为   1.7ml   （0.2-3.5ml），中位cfDNA含量为   17.2ng   （0.32-1000ng），GuardantOMNI检测建议起始量为   30ng   （22%样本起始量<30ng）  

▲ ctDNA分析及bTMB算法

▲ GuardantOMNI TMB分析流程

▲ 使用bTMB算法校正

最小p值交叉验证的最佳cut-off值：使用Cox比例风险模型和最小P值交叉验证方法来确定最佳bTMB临界值。根据验证集的HR值验证最佳截点，上述步骤重复10000次。

结果：

① 在MYSTIC研究中，可以从大多数患者的血浆样本中提取ctDNA进行体细胞突变的检测，并随后进行bTMB的计算。血液bTMB的成功检测率（809/1001; 81％）大大高于组织tTMB的成功检测率（460/735; 63％）。

▲ 各研究组中，可评估bTMB和tTMB患者比例

bTMB检测失败原因：1,001例血液样本可供检测，有效bTMB为809例，成功率81%；失败原因包括血液QC不合格（58例），肿瘤脱落量低（最大VAF<0.3%，41例），低分子覆盖度（39例），克隆性造血基因为主突变（51例），污染（3例）；

tTMB检测失败原因：735例肿瘤组织样本可供检测，有效tTMB为460例，成功率63%；失败原因包括：肿瘤组织和/或肿瘤细胞不足（66.2%），DNA提取量不足（12.3%），NGS文库质量不高（21.5%）。

② 最小的P值交叉验证分析证实，选择bTMB≥20mut/Mb是最佳的临界值，durvalumab + tremelimumab联合治疗临床获益最高。

▲ 不同bTMB阈值时，D+T与化疗的HR值

③ bTMB（≥20mut/Mb）与tTMB（≥10mut/Mb）之间具有相关性，spearman相关系数为 0.6。

▲ MYSTIC中bTMB和tTMB之间的相关性

此次NSCLC试验中，血液样本比组织样本更容易获得（1,001例 vs 735例），在MYSTIC研究中观察到血液样本比组织样本检测成功率更高（81% vs 63%），这些数据都很重要，因为生物标志物可评估人群的大小将直接决定在临床试验中使用相关生物标志物来确定关键临床终点患者人群的可行性。

综合来看，此次研究表明了一种用于定量血浆样本中bTMB新算法的可行性、准确性和重现性。与tTMB相比，MYSTIC研究中的bTMB分析成功率更高，侵入性更小。使用新的bTMB算法和最佳bTMB cut off值≥20 mut/MB，可观察到更高的PFS和OS。证明了bTMB是一个有前途的免疫检查点抑制剂预测生物标志物。

延伸内容：

2020年8月26日，FDA批准第二个基于NGS的液体活检伴随诊断大panel产品FoundationOne Liquid CDx（F1LCDx）上市，检测324个基因，并获得了FDA的批准，可以报告311个基因的点突变和插入缺失突变情况，4个基因的重排和3个基因的拷贝数变异。

作为一项未经FDA审查或批准的实验室专业服务，F1LCDx还可以分析bTMB、MSI-H状态和肿瘤细胞含量（tumor fraction）。所有324个基因的综合结果，包括bTMB、bMSI-H状态和肿瘤细胞含量，在报告的专业服务部分报告。

2020年的11月11日，《中国癌症防治杂志》发表了《肿瘤突变负荷检测及临床应用中国专家共识（2020年版）》，其中专家共识3指出：  目前研究证据显示在NSCLC中bTMB与tTMB 具有显著相关性，但bTMB检测无统一标准。  多项回顾性研究发现高bTMB与NSCLC患者接受单药ICIs治疗获益显著相关，但尚未获得高级别前瞻性临床研究证实。

参考资料：

1.Gandara DR, Paul SM, Kowanetz M, Schleifman E, Zou W, Li Y, et al. Blood-based tumor mutational burden as a predictor of clinical benefit in non-small-cell lung cancer patients treated with atezolizumab. Nat Med 2018;24:1441–8.

2.Socinski M, Velcheti V, Mekhail T, Chae YK, Leal TA, Dowell JE, et al. Final efficacy results from B-F1RST, a prospective phase II trial evaluating blood-based tumour mutational burden (bTMB) as a predictive biomarker for atezolizumab (atezo) in 1L non-small cell lung cancer (NSCLC). Ann Oncol 2019;30 (abstr. LBA83).

3.Herbst RS, Giaccone G, de Marinis F, Reinmuth N, Vergnenegre A, Barrios CH, et al. Atezolizumab for first-line treatment of PD-L1–selected patients with NSCLC. N Engl J Med 2020;383:1328–39.

4.Aggarwal C, Thompson JC, Chien AL, et al. Baseline plasma tumor mutation burden predicts response to pembrolizumab-based therapy in patients with metastatic non-small cell lung cancer [published online ahead of print February 26, 2020]. Clin Cancer Res. 

5.Si Han,Kuziora Michael,Quinn Katie J et al. A Blood-based Assay for Assessment of Tumor Mutational Burden in First-line Metastatic NSCLC Treatment: Results from the MYSTIC Study.[J] .Clin Cancer Res, 2020, undefined: undefined.