桔梗皂苷D对大鼠神经病理性疼痛及脊髓小胶质细胞活化的影响

1首都医科大学附属北京天坛医院麻醉科 100070；2郑州大学第一附属医院麻醉科 450052；3华中科技大学同济医学院附属同济医院麻醉疼痛研究所 430030

【论著】

本研究旨在探讨桔梗皂苷D（PD）对大鼠神经病理性疼痛模型的镇痛作用及其对脊髓小胶质细胞活化的影响。以期为PD用于临床治疗神经病理性疼痛提供理论依据。

将60只雄性成年SD大鼠按随机数字表法分为6组（每组10只）：假手术组（Sham组）、脊神经结扎（SNL）组（SNL组）、SNL+生理盐水组（SNL+NS组）、SNL+PD低剂量组（PDl组）、SNL+PD中剂量组（PDm组）、SNL+PD高剂量组（PDh组）。SNL大鼠结扎和剪断左L5脊神经，Sham组大鼠只分离神经不进行结扎剪断处理；SNL+NS组、PDl组、PDm组和PDh组大鼠于造模后当天开始分别经口灌胃生理盐水或PD（1、5、10 mg/kg）至术后7 d。分别于术前1 d 和术后1、3、5、7、10、14 d测定各组大鼠机械刺激缩足反射阈值（PMWT）和热刺激缩足反射潜伏期（PWTL）。于术后7 d取大鼠脊髓，采用免疫荧光和Western blot法检测脊髓小胶质细胞离子钙接头蛋白分子1（Iba‑1）的表达，ELISA法检测脊髓促炎症细胞因子TNF‑α、IL‑1β和IL‑6的含量变化。

2.1　各组大鼠各时点PMWT比较

与Sham组比较，SNL组、SNL+NS组、PDl组、PDm组和PDh组大鼠术后1、3、5、7、10、14 d 术侧PMWT明显降低（P<0.05）。与SNL+NS组比较，PDm组、PDh组大鼠术后3、5、7、10、14 d术侧PMWT升高（P<0.05）；而PDl组术侧PMWT差异无统计学意义（P>0.05）。与PDm组比较，PDl组和PDh组大鼠术后3、5、7、10、14 d术侧PMWT降低（P<0.05）。SNL组、SNL+NS组及PDm组大鼠术后各时间点对侧PMWT与术前1 d比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见图1。

2.2　各组大鼠各时点PWTL比较

与Sham组比较，SNL组、SNL+NS组、PDl组、PDm组和PDh组大鼠术后3、5、7、10、14 d术侧PWTL明显降低（P<0.05）。与SNL+NS组比较，PDm组大鼠术后5、7、10、14 d术侧PWTL升高（P<0.05），而PDl组和PDh组术侧PWTL差异无统计学意义（P>0.05）。与PDm组比较，PDl组和PDh组大鼠术后5、7、10、14 d术侧PWTL降低（P<0.05）。SNL组、SNL+NS组及PDm组大鼠术后各时间点对侧PWTL与术前1 d比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见图2。

2.3　各组大鼠术后7 d脊髓Iba‑1表达比较

免疫荧光检测结果显示，与Sham组比较，术后7 d SNL组大鼠脊髓Iba‑1的表达明显升高（P<0.05）；与SNL+NS组比较，PDm组术后7 d大鼠脊髓Iba‑1的表达明显降低（P<0.05），见图3。

阳性细胞（即小胶质细胞）的定量分析]Western blot检测结果显示，与Sham组比较，术后7 d SNL组大鼠脊髓Iba‑1的表达明显升高（P<0.05）；与SNL+NS组比较，PDm组术后7 d大鼠脊髓Iba‑1的表达明显降低（P<0.05），见图4。

2.4　各组大鼠术后7 d脊髓TNF‑α、IL‑6、IL‑1β含量比较

与Sham组比较，术后7 d SNL组大鼠脊髓组织中IL‑1β、TNF‑α及IL‑6含量明显升高（P<0.05）；与SNL+NS组比较，术后7 d PDm组大鼠脊髓组织中IL‑1β、TNF‑α、IL‑6的含量明显降低（P<0.05）。见图5。

慢性疼痛尤其是神经病理性疼痛给患者经济和生活带来巨大的影响。本研究通过构建大鼠左L5脊神经结扎模型，诱导神经病理性疼痛的发生。研究结果表明，建模后大鼠术侧后爪PMWT和PWTL明显降低，并出现跛行、缩爪、舔舐足底等疼痛行为学改变，提示大鼠SNL模型制备成功。根据以往研究文献，本实验选择3个剂量PD（1、5、10 mg/kg），探讨其镇痛效应及可能的作用机制。

本研究中大鼠行为学结果显示：持续给予SNL模型大鼠PD（5 mg/kg）可有效减轻外周神经损伤所引起的痛觉过敏和痛觉超敏。与术前基础痛阈和术后各时间点痛阈值比较，PDm组大鼠对侧后爪疼痛行为学差异无统计学意义，表明PDm不干扰正常大鼠的痛觉。连续给予PD 1 mg/kg未显示出镇痛效应。5 mg/kg而非10 mg/kg的PD可以产生最佳的镇痛作用，可能是因为10 mg/kg的剂量反而有毒性作用，但具体机制仍需要进一步研究证实。研究显示PD可以抑制小胶质细胞活化和免疫反应，因此，我们推测PD缓解神经病理性疼痛可能与小胶质细胞活化有关。免疫荧光与Western blot结果显示，SNL组大鼠脊髓背角小胶质细胞表达明显增多，Iba‑1水平明显升高，PD（5 mg/kg）能够有效抑制SNL大鼠脊髓Iba‑1的表达增加，提示PD能够抑制神经病理性疼痛大鼠机械痛觉和热痛觉过敏形成，其作用机制可能与其抑制大鼠脊髓小胶质细胞活化有关。

本研究中ELISA结果显示，SNL大鼠术后脊髓中的促炎症细胞因子TNF‑α、IL‑1β、IL‑6 表达明显升高，持续给予PD后，上述炎症因子表达明显降低，提示PD可以通过抑制SNL所引起的炎症因子的释放而产生镇痛效应。但PD是否通过抑制TNF‑α、IL‑1β、IL‑6影响神经突触信号传递来发挥镇痛效应还有待于进一步证实。

综上所述，本研究结果显示，PD可通过抑制大鼠脊髓小胶质细胞活化，进而减少炎性细胞因子TNF‑α、IL‑6及IL‑1β的含量，抑制过度的神经炎症反应，对SNL大鼠产生抗炎镇痛效应，为PD治疗神经病理性疼痛提供了新的理论依据。

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