七氟烷麻醉对体内结合单胺氧化酶-B的放射性配体的影响

背景

吸入麻醉药物主要通过构象依赖两性分子通道起作用，包括膜蛋白结合离子通道和受体配体结合离子通道。基于突变动物模型和使用高分辨率成像技术结构分析，吸入和静脉麻醉药物的单个或多个作用靶点已经明确定位于抑制或兴奋性配体受体门控通道。吸入麻醉药物如七氟烷、地氟烷和异氟烷呈剂量依赖性降低神经元兴奋性-增强抑制性神经元γ氨基丁酸（GABA）受体信号通路，抑制兴奋性谷氨酸依赖性突触传递。

与丙泊酚不同的是，七氟烷在临床有效浓度范围内对中枢和外周神经系统的蛋白质受体有高度亲和力，这种多靶点结合导致与麻醉功效非相关性的潜在副反应。

PET分子成像技术能够鉴别麻醉药物亚细胞结构靶点，为进一步探讨其在体内神经化学作用特性提供了依据。PET能够动态监测麻醉药物人体脑代谢和脑灌注，异氟烷、七氟烷和丙泊酚麻醉的受试者，放射性配体与GABAA受体亲和力增加，提示这一靶点与吸入麻醉药物作用机制相关。然而有趣的是，区域大脑麻醉和受体密度的研究显示GABAA受体与丙泊酚的亲和性远大于异氟烷，进一步提示吸入麻醉药物起效涉及多个分子靶点。

放射性配体[11C]AZD9272最初用于代谢性谷氨酸受体-5（mGluR5）的成像，然而出乎意料的是，该特异成像在七氟烷麻醉的NHPs明显低于氯胺酮/甲苯噻嗪组以及清醒人类受试者，表明[11C]AZD9272与吸入麻醉药共享同一个结合位点。同时，[11C]AZD9272与MAO-B抑制剂敏感的非mGluR5受体也能特异性结合（约90%），由此研究者提出假说：七氟烷抑制[11C]AZD9272与MAO-B的结合。

本研究探讨吸入麻醉药对脑内MAO-B的影响。最初的设想是采用[11C]AZD9272来观察七氟烷或氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉的NHPs脑内成像，但基于随后AZD9272和MAO-B抑制剂共享结合位点的研究，MAO-B抑制剂-放射性配体[11C]L-deprenyl-D2也被纳入本试验。本试验采用预测人类药物受体结合率稳定性模型-猕猴作为研究对象。

方法

放射性配体：[11C]AZD9272：钯介导的11C芳香溴化物前体5-（3-bromo-5-flfluorophenyl）-3-（5-flfluoropyridin-2-yl）-1,2,4- oxadiazole的氰化；

[11C]L-deprenyl-D2：室温下，11C三氟甲基使得去甲基L-deprenyl-D2前体N-甲基化。

两类放射性配体的注射剂量分别为：112~212 MBq和153~167 MBq。

PET：该研究获斯德哥尔摩北部地区动物研究伦理委员会批准（Dnr N185/14），严格按Karolinska 研究所计划、执行和记录实验指南以及饲养和使用实验动物指南进行，共纳入3只雄性和3只雌性猕猴，平均年龄8（6~10）y，平均体重7.6（6.8~9.3）Kg。麻醉实施：盐酸氯胺酮~10 mg ·Kg-1肌注。

6只NHPs共12次PET监测（Table 1）。[11C]AZD9272组：3只NHPs（NHP#1-3）两种方式麻醉维持，分别给予空氧混合下七氟烷3.0vol%，或静脉输注盐酸氯胺酮（4mg·Kg-1·h-1）和盐酸甲苯噻嗪（0.4mg·Kg-1·h-1）。麻醉诱导后，试验动物分别予以机械通气，维持ETCO24-5vol%，FiO20.3-0.4，[11C]AZD9272组：Dräger Infifinity Delta [Dräger, Lubeck, Germany]；[11C]L-deprenyl-D2组：Dräger Zeus [Dräger]。PET实验期间，持续监测食道温度，HR和RR。

[11C]AZD9272组，同一NHP的PET测量至少间隔6周；[11C]L-deprenyl-D2组，3只NHPs（NHP#4-6）两次PET测量在同一天进行，包括首次七氟烷麻醉和其后的氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉，如上图所示。

麻醉诱导后，每一只NHP使用头部固定架，PET测量使用高分辨率研究断层扫描，图像重建采用三维图像重建迭代算法（OSEM）。每例PET前，NHP小腿静脉给予无菌生理磷酸盐缓冲（PH7.4）示踪剂，注射时间大于5S。基于前期示踪剂相关研究，[11C]AZD9272组持续获取123min数据，[11C]L-deprenyl-D2组为93min。

PET测量前3min，自动血液采样系统（ABSS）留存动脉血。随后，[11C]AZD9272组在注射后3, 4, 5, 8, 15, 30, 45, 60, 75, 和90 min分别手动采集动脉血1-3ml；[11C]L-deprenyl-D2组则在注射后5, 15, 30, 45, 60, 和90min采样。离心后，取0.2-1.5ml血浆进行放射性计数器测量。同时，在0.5, 1, 1.5, 2,和2.5 min，ABSS系统直接取样与计数器交叉校准，测定血浆/全血比值。[11C]AZD9272组在5, 15, 30, 45, 60, 75, 和90 min，[11C]L-deprenyl-D2组在2, 5, 15, 30, 45, 60, 和 90 min分别测量动脉血血浆放射性标记配体放射分数。超滤法分析血浆中游离配体。

数据分析

放射性配体活跃脑区（ROIS）进行手工划分评估。PET数据采用代谢产物纠正的动脉血浆曲线，药代动力学两室模型进行分析，两室分别对应游离的非特异性结合配体和特异性结合配体，浓度分别为CND（t）和CS（t）（Fig.1）。Cp（t）代表血浆中示踪剂浓度。K1, k2, k3,和 k4分别为速率常数，其中K1、K2通过血脑屏障的速率常数，K3、K4特异性结合解离常数。采用动力学建模估计分布值VT，对[11C]AZD9272配体可逆性结合量化分析，如公式（1）所示，被用来进行放射性配体结合的定量分析。

放射性配体[11C]L-deprenyl-D2与受体不可逆结合，因此解离常数忽略不计，即K4≈0。

K1/k2*k3 （λk3） 具有可重复性，被用来评估[11C]L-deprenyl-D2与MAO-B的结合率。PET数据处理PMOD v. 3.6，[11C]AZD9272：K3/K4；而[11C]L-deprenyl-D2：K3。两种放射性配体特异性结合相对差Δk-s则分别基于VT和λk3进行评估。

由等式（1）可见，[11C]AZD9272组Δk-s不能从VT直接计算而不通过λ（K1/K2），但是可以通过多脑区VT分析由图形法获得。七氟烷或氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉下，以不同脑区的V_T, _ketamine和V_T, _{sevoflflurane}差值为纵坐标，V_T, _ketamine为横坐标作图，曲线斜率即为Δk-s，见等式（2）。

囊括12个脑区的数据，分别为：前扣带回皮质，尾状核，小脑，海马，岛状皮质，枕叶皮质，前额叶皮质，壳核，颞叶皮质，丘脑，腹侧中脑，腹侧纹状体。

[11C]L-deprenyl-D2组Δk-s通过丘脑的λK3计算，见等式（3）。

PET数据采集中，根据心率和循环血压调节呼气末七氟烷浓度为2.5-3.8vol%（Table 1）。

各NHP均无对生命体征产生影响的麻醉相关副反应，本实验持续监测氧饱和度和食道温度。血浆游离配体分数在氯胺酮/甲苯噻嗪或七氟烷麻醉相似（0.22~0.32 vs 0.21~0.25 for [11C]AZD9272， 0.17~0.23 vs 0.19~0.21 for[11C]L-deprenyl-D2）。[11C]AZD9272放射性代谢率在七氟烷组（60min，63-79%放射性配体母液）明显快于氯胺酮/甲苯噻嗪组（60min，85-89%放射性配体母液），而[11C]L-deprenyl-D2放射性代谢率两组相似（60min，7-14%放射性配体母液）。（Supplementary Fig：S1）

所有脑区，七氟烷组两种放射性配体特异性结合率明显低于氯胺酮/甲苯噻嗪组（Table 2; Fig. 2a and b; Supplementary Fig. S2）。[11C]AZD9272组V_T, _ketamine和

V_T, _{sevoflflurane}e差值通过12个脑区成像并标注，与V_T, _ketamine作图（等式2），斜率即为Δk-s，相应值为80-90%（n=3; Fig. 3）。基于丘脑估算的[11C]L-deprenyl-D2组λK3相应值为77-80%（n=3）。

讨论

麻醉可影响实验动物的PET成像。[11C]AZD9272-PET放射性配体，最初用来研究mGluR5的脑成像，被意外发现易于与吸入麻醉药结合。此外，我们最近的研究提示放射性标记的AZD9272以灵长类动物大脑MAO-B为主要结合位点，而吸入麻醉药抑制[11C]AZD9272与MAO-B的结合。我们的实验也证实七氟烷麻醉下[11C]AZD9272与灵长类动物大脑的低结合率。同样，七氟烷麻醉下MAO-B与选择性配体[11C]L-deprenyl-D2结合率明显低于氯胺酮/甲苯噻嗪组。以上发现均支持--七氟烷影响放射性配体与MAO-B的结合这一假说。

吸入麻醉药已被证实作用于多个信号蛋白，因此我们提出七氟烷是否与MAO-B特异性结合。虽然吸入性麻醉药通常使用于NHP的PET研究中，但迄今尚未证实七氟烷影响其他蛋白质靶点的结合，如[11C]raclopride与多巴胺（D2）受体的结合，以及[11C]AZ10419369与5-羟色胺（5-HT1B）受体的结合。放射性配体与5-羟色胺受体的结合，在清醒NHP和异氟烷麻醉NHP中显示出一致性。这些发现提示七氟烷影响放射性配体与MAO-B的结合，并不普适于其他受体和酶的结合。

虽然目前没有麻醉导致MAO-B活性缺失的报道，但有证据表明暴露于乙烷和氯仿的组织匀浆中MAO-B活性受到抑制。氟烷抑制静脉舒缩反应，其中MAO受抑制被认为是其发生的潜在机制，提示与MAO结合可能为挥发性麻醉药的共性。全身血压下降被认为是七氟烷麻醉或使用MAO抑制剂治疗过程中的常见反应。该降压的机制未完全阐明，通常认为MAO抑制剂和吸入麻醉药抑制交感神经和外周血管张力。我们的观察发现临床剂量的七氟烷降低MAO-B与配体的结合，提示MAO-B途径可能是吸入麻醉药导致血压降低的潜在机制。

七氟烷为试验动物PET研究的主要麻醉剂，PET成像研究中七氟烷挥发罐输出恒定，浓度可根据实验动物的生命体征调节。以往的实验数据显示同一研究中，七氟烷浓度的并非恒定不变（最大3倍）。放射性配体与MAO-B结合对七氟烷敏感，提示其不能在NHPs作为PET成像该结合位点的最优选择。

与清醒状态相比七氟烷降低整体脑血流，提示七氟烷麻醉下低放射性配体结合率反映了结合蛋白可能与大脑血流量变化相关。等式（VT和λK3）主要相关参数-速率常数K1和K2与血流函数有关，但K1/K2被认为流量不相关。[11C]AZD9272结合率评估基于VT-代表示踪剂参数，稳态下血浆分布率，不能反应血流量的变化。然而，不可逆结合配体L-deprenyl在结合速率相对快于血浆解离速率时，呈流量依赖性。为了降低流量的干扰和混杂因素，代谢稳定的氘取代类似物L-deprenyl在此试验中选做放射性配体，NHPs在七氟烷或氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉，K1仅有轻微变化（Supplementary Tables S1 and S2）。因此放射性配体结合率的差异不能反映麻醉相关脑血流的变化。

参数λ（K1/K2）代表示踪剂在脑组织和血浆中的非特异性结合，与血浆中游离分数呈正比。游离分数随放射性配体的血浆结合率变化而改变，然而PET成像中不同麻醉条件下呈现相似的放射性配体游离分数。七氟烷作为抑制剂测得[11C]AZD9272的λ（2.1-3.5ml cm-3）与初始值（1.7-3.3ml cm-3）一致。这一结果支持：测量结果的差异反映出麻醉剂主要影响特异性结合。

七氟烷抑制了放射性配体[11C]AZD9272和[11C]L-deprenyl-D2与靶蛋白的结合。其中L-deprenyl为MAO-B抑制剂，AZD9272是否与其功能一致仍有待商榷。鉴于AZD9272、七氟烷和L-deprenyl化学结构迥异，竞争性抑制似乎不存在。

在NHPs所有脑区，七氟烷组[11C]AZD9272的VT值明显低于氯胺酮/甲苯噻嗪组。异氟烷麻醉中，[11C]AZD9272特异性结合率下降程度与七氟烷类似（相对于氯胺酮/甲苯噻嗪有81%差异，Supplementary Fig. S3），丙泊酚麻醉则显示与氯胺酮/甲苯噻嗪相似的VT值（Supplementary Fig. Table3）。初步研究发现，放射性配体与MAO-B结合的抑制效应仅存在于吸入性麻醉剂。

NHP是预测药物对人类作用的天然模型。MAO-B在灵长类和啮齿类动物的药理学差异已被报道，目前尚不清楚七氟烷对啮齿类动物MAO-B是否产生相同影响。需要进一步的研究来评估七氟烷是否对其他物种的MAO-B结合率产生影响。

总之，七氟烷明显抑制体内放射性配体与MAO-B的结合；临床浓度的七氟烷影响MAO-B结合率，表明七氟烷可能不是PET研究此结合位点的最佳麻醉剂。七氟烷临床浓度下，降低MAO-B结合率值得进一步探索-全麻下血压调节的潜在机制。