cfDNA技临FAQ

cfDNA技临FAQ

Q1：抽提cfDNA所需的血浆/血清制备，有什么特别需要注意的地方？

A：抽提cfDNA所需的血浆/血清制备过程，和常规血清/血浆制备有一些不同和需特别注意之处：

血清/血浆通常需要经过“两步离心法”制备，第一步离心采用常规的血清/血浆制备离心速度，第二步需要采用高转速（14000-16000g），用于去除血浆/血清中可能残留的细胞碎片和一些破碎细胞释放的基因组DNA。

血浆/血清制备过程尽可能避免溶血，例如减少抽血到血浆/血清制备的时间，离心转速严格控制等。因为破碎的血细胞释放的基因组DNA可能会大大稀释较微量的cfDNA，影响后面检测的准确性。

Q2：抽提的cfDNA如何质控？

A：由于cfDNA含量很低，大部分是1-100ng/ml （对于部分特殊病理状况下，可能会在这个范围之外），因此对cfDNA的质控方法是一种挑战。

Q3：抽提的cfDNA如何定量？

A：cfDNA的片段分布可以通过Agilent2000（2100）来确定。

在cfDNA极其低的情况下，它的定量测定极易受到少量单链核酸，蛋白质和RNA的污染，因此对于采用紫外吸光法的定量策略，例如NanoDrop，可能并不适合。相对来说，Qubit较多地用于cfDNA的定量（Qubit®dsDNA HS assay）。

另一种较精确的方法，就是采用qPCR的方法。它主要是通过针对基因组中高度重复序列（如LINE-1，Alu等）设计扩增片段，通过检测目标片段在qPCR反应中Cq值，参照基于标准品绘制的浓度曲线，从而确定cfDNA的浓度。

Q4：目前有没有特殊的方法可以在cfDNA中富集ctDNA？

A：目前由于我们对于ctDNA的性质，除了对其携带突变这一特征比较明确外，其他物化性质了解得较有限。但是由大量研究提示ctDNA大多集中在150-200bp这个大小的片段中。因此，理论上可以对这部分大小的核酸片段进行分级分离（Sizefractionation），以实现对ctDNA的富集。现已有相关试剂盒商业化“TheEpiQuik™ Circulating Cell-Free DNA Isolation Kit”，但其抽提的依然是cfDNA【北京有代理商】。

临床FAQ：

Q1：cfDNA的历史?

A：cfDNA最早的发现就不是在肿瘤患者的血样中，他是1947年由法国科学家Mendel和Metais在健康人的血清和血浆中通过高氯酸沉淀的方法发现了存在DNA。但在那个时候，人类都还没有意识到DNA是遗传物质（1953年DNA双螺旋的发现才给足DNA作为遗传物质的名分），因此并没有充分地引起大家重视。

人们第一次发现肿瘤和血清中的DNA含量存在一定关系是在1977年，但当时并无法知道这些DNA是否来自于肿瘤细胞还是正常组织。直到1989年，人们才通过DNA链的热力学稳定性比较，第一次确定在肿瘤患者血浆中发现的DNA有一部分是来自于肿瘤细胞的。与肿瘤不同，cfDNA最早引发医学界普遍重视是在20世纪60年代，当时人们在系统性红斑狼疮的患者体内发现很高水平的cfDNA。

因此，从cf DNA的科学发现史上看可以发现它不是肿瘤生物学的专宠。

Q2：外周血中的cfDNA的含量，说明什么？

A：有研究已经证实，肿瘤患者外周血中的cfDNA总量，要高于健康人。通过这一点，虽然不能武断的说cfDNA能成为肿瘤标志物，但是cfDNA的含量增多，能起到一个较好的提示作用，作为一个初筛的手段。

Q3：无创性cfDNA检测，检材是否只局限于外周血？

A：作为一种无创检测，cfDNA检测最常用的检材是外周血。但也有很多研究证实尿液和唾液也能够检测到cfDNA。

Q4：cfDNA与机体细胞损伤相关疾病？

A：cfDNA来源于机体细胞损伤，因此我们可以做一个思维实验：对于健康的人，他血液中的cfDNA主要来源是体细胞正常的新陈代谢，因此应该维持在一个较低的水平。然而，当有很严重的系统性器官损伤时，大量死亡的细胞（不管是凋亡或是坏死）会产生大量的cfDNA。因此，我们就有可能通过cfDNA的含量变化，来对这类型疾病进行一个评估。

目前已经有很多文献，证实在包括系统性红斑狼疮在内的风湿性关节炎，肾小球肾炎，胰腺炎，炎症性肠病、肝炎等炎症疾病患者血浆中，都能够显著性地检测到cfDNA相比健康人群含量大大增加。

因此，似乎cfDNA的临床应用方向，更多地是和显著性的机体细胞损伤这一病理性情境相关联。但是，这个结论可能还要排除掉一些特殊情况。我能想到的一种情形，就是短时程，急性的器官性损伤，例如药物的毒性。因为对于代谢较快的药物来说，它发挥细胞毒性时间窗口较窄，相应地引发的细胞损伤造成的cfDNA检测窗口也会较窄。因此，我们很可能检测不到预期的cfDNA的含量和细胞毒性成正比。

Q5：基于cfDNA的液态活检（对于肿瘤来说即是ctDNA），是否只应用于肿瘤？

A：尽管ctDNA在肿瘤诊疗中的应用是当下cfDNA最广泛，研究最深入的分支。但是，cfDNA作为液态活检，不只是局限于肿瘤学。例如，有研究报道对于接受器官移植手术的病人，可以通过监测术后外周血中具有捐献者基因特征，片段化的cfDNA含量变化，来评估移植器官的排斥情况。

Q6：cfDNA检测能否比现有手段更好？

A：在没有分子生物学技术高速发展的时候，临床医学已经发展出很多检测手段用来评估cfDNA打算应用的临床舞台。例如肝损伤有一整套肝功能指标，肾损伤有一整套肾功能指标，自身免疫性疾病有一整套评价标准，它们现在看起来用得还不错。即使针对cfDNA本身，现有的评估体系中也有基于anti-dsDNA，anti-ssDNA抗体的ELISA与我们熟悉的核酸检测技术（如PCR，测序等）竞争。