小胶质细胞清除有望改善脊髓损伤后认知功能障碍

【研究方法】

  选择成年雄性C57BL / 6小鼠建立中度/重度胸脊髓挫伤模型，分别在损伤前3周或损伤后1天开始施用PLX5622诱导小胶质细胞耗竭，并持续应用至SCI后6周。使用流式细胞计数和NanoString技术评估受伤的脊髓和大脑中的神经炎症情况，结合一系列神经行为学方法评估各组小鼠神经功能情况（包括运动功能，认知和抑郁）。

【研究流程】

第一步：为明确SCI后小胶质细胞耗竭对中枢神经系统细胞浸润的影响，从SCI前3周开始，给C57BL / 6小鼠饲喂含有小胶质细胞耗竭药物PLX5622的粮食，或仅含有溶媒的粮食作为对照。SCI模型建立后第2天，心脏穿刺抽血（200μL）分析白细胞组成并解剖受损伤的脊髓周围约1 cm的新鲜组织，制备细胞悬液，进行流式细胞计数以及RNA提取。

第二步：为了测试损伤后小胶质细胞的消耗是否影响急性炎症反应，从脊髓损伤造模之日起直到处死前，给小鼠饲喂PLX5622粮食或溶媒。在SCI造模前后记录体重和食物摄入量。受伤后第7天，解剖脊髓损伤周围约1 cm的新鲜组织以及脑组织，以进行流式细胞分析。

第三步：研究损伤后小胶质细胞耗竭是否会影响SCI后的神经功能。从造模当日开始，给予小鼠PLX5622或对照食物处理。所有动物在造模后的1、3、7、14、21、28、35、42天进行运动功能测试。损伤后5周开始，所有小鼠都进行了一系列的神经行为学测试（包括旷场试验、步态测试、Y迷宫以及新物体识别测试）；通过悬尾实验以及强迫游泳实验评估小鼠的抑郁样行为。损伤后第6周，收集各组小鼠的脊髓和脑组织用于NanoString分析。

第四步：为了确定PLX5622对运动功能的影响是否取决于损伤的严重程度，研究者们对Cx3xr1-GFP雄性小鼠进行了重度挫伤处理（70 kdyn）或假手术处理。从造模日开始对动物进行PLX5622饲喂，持续最多6周。在受伤后的1、3、7、14、21、28、35、42天进行运动功能测试。损伤后6周， 收集受伤的脊髓和脑组织行NanoString分析和免疫荧光检测

【研究结果】

  流式细胞仪分析表明，PLX5622在假手术条件下可显著减少脊髓中CD45^intCD11b ⁺小胶质细胞的数量（图1E）。SCI造模后，模型组小鼠脊髓中小胶质细胞计数均增加，但与饲喂溶剂组相比，连续的PLX5622处理显著减弱了CD45^hiCD11b⁺浸润细胞的数量。鉴于氧化应激在中枢神经系统无菌性损伤和炎症中的关键作用，研究者使用DHR123评估免疫细胞中ROS的产生水平。尽管在PLX5622处理期间小胶质细胞明显减少，但在溶剂治疗组中，SCI造模后小胶质ROS水平要明显更高。与SCI / Veh对照相比，在PLX5622治疗期间，滤过的单核细胞和嗜中性粒细胞中ROS产生相对减少（图1G）。

图1.用PLX5622预先清除小胶质细胞可减少SCI后的脊髓浸润细胞和活性氧（ROS）的产生

    为了测试损伤后小胶质的耗竭是否会影响急性炎症反应的消退，在受伤后的第1天将PLX5622饮食或媒介食物喂给动物，并维持7天。研究者们发现，与受伤的对照组相比，连续的PLX5622处理可显着减少脊髓损伤部位的小胶质细胞和浸润性髓细胞计数（图2E）。有趣的是，尽管如预期的那样，在药物治疗期间大脑中的小胶质细胞计数明显减少，但研究者还观察到大脑中的其他髓样细胞群体也出现了显著减少（图2G）。这些结果表明，小胶质细胞促进了损伤后白细胞的浸润。

图2.受伤后，PLX5622治疗会在脊髓损伤后7天减少脊髓和大脑中的小胶质细胞和浸润细胞

    接下来，研究者进一步探讨了SCI造模后小胶质细胞减少和单核细胞浸润是否会影响神经功能。SCI造模后，小鼠的步态规律性指数降低了近一半，而PLX5622处理使小鼠步态得到了明显改善，接近正常步态的60％，与SCI / Veh动物相比，行PLX5622治疗可显着改善SCI小鼠的后爪的位置（图3D-G）。

图3.SCI后PLX5622消除小胶质细胞可改善步态

那么，小胶质细胞耗竭对SCI后认知功能和抑郁样行为的是否具有长期影响呢？研究者接下来进行了各种神经行为学测试。SCI造模后6周通过新物体识别（NOR）测试评估非空间记忆。在训练阶段，假手术组小鼠和SCI小鼠在两个相同的物体上花费的时间相同（图4A），这表明各组小鼠的记忆均是完整的。训练后24小时，SCI / Veh小鼠花费在新物体上的时间明显减少，SCI / PLX小鼠显示出与新物体相互作用的时间增加，表明PLX5622的应用使小鼠的短期识别记忆得到了改善（图4B）。研究者们通过悬尾实验和强迫游泳实验检测小鼠的抑郁行为发现，与SCI / Veh组相比，SCI / PLX小鼠的不动时间显著减少，这也表明PLX5622可显著改善SCI小鼠的抑郁行为（图4F-G）。

图4.PLX5622对小胶质细胞的系统耗竭改善了SCI后的认知和抑郁样行为

图5. SCI后清除小胶质细胞能够改善多个脑区中的神经退行性变

【研究结论】

本项研究结果提示，CSF1R抑制剂PLX5622，无论是在受伤之前还是之后开始应用，都可以在受伤的急性阶段显著减少脊髓和大脑的炎症反应，与此同时，PLX5622还能够减轻慢性神经炎症。这些发现表明，慢性神经炎症所产生的毒性作用，可能是SCI介导的神经功能缺损的主要病理生理因素。同时，我们有理由认为：SCI后的抑郁症不一定是“反应性的”，而是确实存在特定的神经病理学改变引起的。本研究结果也提示我们，在临床上或许可以通过靶向治疗神经炎症来改善这种改变。