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科研 | 西北农林科技大学 FEMS Microbiol. Ecol.：高海拔极端条件下山羊胃肠道微生物的组成和功能适应性

2021

04/14

微生态

A-

A+

本研究揭示了在具有挑战的环境和饮食条件下，半野生山羊胃肠道中微生物组的分类学和功能差异。

导读

反刍动物在粮食安全中发挥着重要作用。其通过瘤胃微生物的发酵作用将人类不可食用的含有木质纤维的植物转化成牛奶、肉类及绒毛等高价值动物产品。因此，调整反刍动物胃肠道对富含粗纤维的粗饲料的利用率是提高反刍动物生产系统营养物质转化效率的重要措施，也是保证全球粮食安全的重要因素。在此背景下，饮食中天然碳水化合物（纤维和非淀粉多糖）对于胃肠道，特别是瘤胃的发育有很大影响。其供应不足会造成瘤胃发育的缺陷，从而降低微生物的消化能力。饮食已被确定为野生和家养动物肠道微生物生态变化的驱动因素。与传统的放牧饲养相比，现代生产体系向反刍动物提供高精料饮食，其单糖和蛋白质与非淀粉多糖的比例要高得多。已有研究证明这会引起胃肠道微生物群的功能和分类组成上的巨大差异。目前就不同饲喂方式对动物肠道微生物的研究较多围绕牛和绵羊进行，而山羊研究较少，但是山羊与前两种物种代表的反刍动物类型截然不同，其具有更强的选择行为，从牛和绵羊到山羊的推断结果并不可靠。鉴于山羊生产系统在全球范围内的重要性，深入研究放牧和舍饲两种不同喂养策略对山羊的影响，对增强反刍动物胃肠道微生物群定植和进化的理解非常重要。

通过对不同物种的野生动物（松毛虫、大木鼠、牛、长颈鹿、食蚁兽、犬科动物、灵长类动物、马科动物和土豚）研究发现，圈养引起了微生物组成和功能的巨大变化。在放牧和舍饲条件下，一些哺乳动物（牛、长颈鹿、食蚁兽和土豚）宿主中的某些细菌类群如厚壁菌门和拟杆菌门的相对丰度发生了较大的变化。这些结果再次证实饮食是肠道微生物组成的主要驱动力。研究还表明，很大一部分变化（∼10%）是由于圈养环境本身造成的。此类数据尚未适用于山羊。此外，抗生素耐药性的日益广泛存在，使得有必要将反刍动物胃肠道在内的各种环境视为新出现耐药性的来源，在抗生素被广泛应用于临床和农业生产之前，微生物群落中就存在耐药性。在放牧和舍饲两种饲养模式下，抗生素抗性基因（ARGs）是否在组成和丰度上存在差异尚不清楚。这一问题从未对极端环境条件下生存的动物有过研究。

本试验对极端环境下自由放养和圈养条件下山羊瘤胃和后肠（盲肠和结肠）微生物群落的分类和功能组成进行了探讨。选择了西藏羌塘国家自然保护区作为试验地点（图1A），它也被称为“世界屋脊”，平均海拔4800米，是一个基本完整的生态系统，几乎不受人类活动的干扰，并且由于高海拔、寒冷、缺氧，以及可利用生物量的缺乏，无疑被认为是地球上最恶劣的环境之一。生活在西藏高原上的人主要依赖于畜牧业作为他们的主要生存方式。本研究主要探寻西藏地区两种饲养模式（放牧和舍饲）下对藏山羊的微生物多样性和功能的影响，该研究的为在极端环境条件下动物胃肠道微生物的建立提供了新的生态学见解。

论文ID

原名：Taxonomic and functionaladaption of the gastrointestinal microbiome of goats kept at high altitude (4800 m) underintensive or extensive rearing conditions

译名：高海拔极端条件下山羊胃肠道微生物的组成和功能适应性

期刊：FEMS Microbiology Ecology

IF：3.675

发表时间：2021.3.21

通讯作者：陈玉林¹，吴玉江²

通讯作者单位：1 西北农林科技大学动物科技学院，2 西藏自治区农牧科学院畜牧兽医研究所

实验设计

选择50只半同胞雌性山羊，出生后随机分配到2种不同的饲养系统中（放牧与舍饲饲养，n=25）。舍饲山羊组通过颗粒饲料和牧草作为饲料来源进行喂养（海拔＞4800 m），并且舍饲山羊允许随母羊生活在一起，直至断奶（图1A）。放牧饲养山羊组允许随母自由活动，不进行任何补饲（尼玛县，西藏，中国，海拔＞4800 m；图1A）。两种饲养模式下羔羊都是相同的断奶年龄，于生后90天断奶。尼玛县绒山羊春季采食的主要牧草是紫花针茅、西藏嵩草、弱小火绒草。本试验采用烷烃技术测定半同胞藏山羊春季采食量和饲料消化率。藏山羊对干物质、粗蛋白、钙、磷（以DM为基准）日摄入量分别为450、32、5.23、0.46 g，平均干物质消化率为45.62±1.65%。放牧山羊日粮的NDF和ADF含量（以DM为基准）分别为55.98±0.10％和34.53±0.10％。从每个组中随机选择5只山羊，并在生后第365天屠宰。试验共收集了60个样品，来自舍饲组和放牧组各30个，包括瘤胃、盲肠和结肠的肠腔内容物和粘膜组织。粘膜组织用无菌载玻片轻轻刮取粘膜组织，用PBS冲洗三次，然后快速放置在2.5 mL管中并储存在液氮中。随后，从肠腔内收集5 mL新鲜的瘤胃、盲肠和结肠内容物，并储存在液氮中以提取微生物DNA。将另外15 ml的瘤胃、盲肠和结肠内容物通过三层粗棉布过滤，并立即进行pH测量。随后，向样品中添加5%的HgCl₂，并将其储存在液氮中以测定短链脂肪酸（SCFA）的浓度。

结果

1 动物生长性能和微生物发酵参数

为了确定GIT微生物群和动物生长性能与饲养条件之间的关系，收集了两个不同饲养方式下山羊的表型数据。研究发现，放牧组和舍饲组的藏山羊初生重并无显著差异（图1B），而1岁龄的舍饲组羔羊平均体重显著高于放牧组羔羊（P=0.007，图1C），增高了48.5%。为了进一步研究饲养环境对瘤胃、盲肠和结肠发酵参数的影响，从每个肠腔采集的样品中测定pH值和SCFA水平。与放牧组的样品相比，舍饲组瘤胃的pH值显著降低（P=0.001，图1D），结肠的pH值显著升高（P=0.03，图1D），而盲肠中的pH无显著差异（P> 0.05，图1D）。此外，藏山羊舍饲饲养显著降低了乙酸的相对丰度（P<0.001，图1E），而显著增加了丙酸的相对丰度（P<0.001，图1E），瘤胃、盲肠和结肠中丁酸的相对丰度无显著差异（P> 0.05，图1G）。

2 前肠和后肠微生物群落组成和功能特征的变化

通过16s rRNA基因测序，从样品中共获得了2,098,000个clean reads，每个样品平均产生32,276个reads。30个肠腔样品通过Illumina HiSeq进行宏基因组测序，剔除低质量reads和宿主污染物后，共得到了289.7Gb cleanreads，平均每个样品获得9.65Gb reads。以N50 contig长度为790.93bp的contig为基础，共鉴定出378万个非冗余基因，平均ORF长度为478bp。

图1：西藏山羊分布地理位置和表型数据。(a)试验研究地点；(b)放牧山羊和舍饲山羊出生重；(c)放牧和舍饲山羊成年体重；GIT腔内pH (d)、乙酸(e)、丙酸(f)、丁酸(g)的变化。采用单因素方差分析的Tukey检验进行组内和组间比较，P>0.05、* P <0.05、** P <0.01和*** P <0.001。

通过宏基因组测序分析，基于门水平研究了不同肠段中的eggNOG同源群（OG）和基因水平的微生物α-多样性（图2A）。试验结果表明，在门水平上，舍饲提高了后肠微生物α-多样性，降低了瘤胃微生物多样性；而在OG水平上，舍饲组瘤胃微生物α-多样性更高；在基因水平上，舍饲喂养则提高了瘤胃和后肠α-多样性。进一步利用qPCR分析总细菌数发现，瘤胃、盲肠和结肠内的细菌总数显著高于粘膜（图2B，P<0.05），并且舍饲喂养的后肠内和粘膜的细菌总数高于放牧组（图2B，P<0.05）。

根据16S rRNA数据在OTU水平进行PCoA分析表明，瘤胃和后肠的微生物群存在显著差异（ANOSIM，Bray–Curtis metric：R₂=0.64，P=0.001；图2C），后肠粘膜和腔内微生物群形成了两个不同的群落（ANOSIM，Bray–Curtis metric：R2=0.43，P=0.001；图2C）。这些结果表明，由于群落结构的差异，后肠（盲肠和结肠）管腔和粘膜微生物群具有不同的营养代谢功能潜力。对肠腔内容物和黏膜样品进行PCoA分析表明，不同饲养条件显著影响后肠微生物群落结构(ANOSIM，Bray–Curtis metric：R₂= 0.67，P=0.001)。粘膜样本的PCoA结果显示，饲养条件对后肠粘膜微生物群没有显著影响。这表明饲养条件对后肠管腔和粘膜中存在的微生物群有不同的影响（ANOSIM，Bray–Curtis metric：R₂=0.57，P=0.001）。

图2：放牧山羊和舍饲山羊GIT微生物组成和功能的比较。（a）门水平，OGs和基因水平的α多样性。（b）放牧山羊和舍饲山羊的肠腔或粘膜中的细菌拷贝数。（c）基于16s rRNA测序数据分析放牧和舍饲山羊条件下肠腔和粘膜微生物组成差异。（d）优势菌门的相对丰度（%）。（e）瘤胃和后肠肠道微生物群的不同功能（丰度显示为log10）。

不同饲养条件之间的表型差异主要受GIT肠腔微生物结构的影响。基于16S rRNA基因测序数据，门和属的相对丰度在瘤胃和后肠的肠腔和粘膜之间显示出不同的微生物结构。此外，在所有样品中拟杆菌门（Bacteroidetes）和厚壁菌门（Firmicutes）均为优势菌门，但在后肠中，厚壁菌门相对丰度高于其他菌门。在瘤胃中拟杆菌（Bacteroidetes）相对丰度高于比其他肠道。在瘤胃粘膜中，变形菌门（Proteobacteria）相对丰度较高，螺旋菌门（Spirochaetae）在盲肠粘膜中普遍和高度特异存在。在属水平上，后肠的主要优势菌为Treponema_2，RuminococcaceaeUCG-005，Ruminococcaceae_UCG-010，Alistipes，Bacteroides，PrevotellaceaeUCG-004 和Ruminococcaceae_UCG-013。瘤胃的主要优势菌为Prevotella_1、Bacterioidales_BS11、Butyrivibrio_2和Prevotellaceae_UCG-001。进一步为了确定肠道细菌与pH和SCFA之间的关系，进行相关分析表明：Clostridium、Alistipes、Ruminiclostridium与pH值和乙酸含量呈正相关，而Methanobrevibacter、Barnesiella与丙酸含量呈正相关，普氏菌属（Prevotella）和丁酸弧菌属（Butyrivibrio）与丁酸含量呈正相关。

有趣的是，山羊中瘤胃和后肠存在不同的功能潜力。与后肠相比，瘤胃微生物组在肽酶、精氨酸和脯氨酸代谢、氧化磷酸化、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、能量代谢和其他离子偶联转运蛋白等通路中高度富集（图2E）。而与瘤胃不同，参与氯代烷烃和氯烯烃降解、过氧化物酶体、溶酶体、乙苯降解、神经营养素信号传导、TGF-β信号、黏附、血管平滑肌收缩、克拉维酸生物合成和白细胞跨内皮迁移等通路在后肠微生物组高度富集（图2E）。

3 放牧山羊和舍饲山羊瘤胃微生物群的组成与功能

利用16S rRNA基因测序数据（ANOSIM，Bray–Curtis metric：R₂=0.46，P=0.001），在OTU水平上，PCoA显示两种饲养条件下的瘤胃肠腔和粘膜的微生物存在显著差异。进一步分析宏基因组数据，结果表明，对于核心属的相对丰度，与放牧组相比，舍饲组的瘤胃内容物中Methanobrevibacter显著较高（P=0.01，图3B），而Alistipes显著较低（P=0.01，图3B）。此外，KEGG通路分析发现舍饲组瘤胃内容物样品中甲烷代谢通路显著富集（P=0.03，图3C），对甲烷代谢通路有重要贡献的核心属甲烷短杆菌（Methanobrevibacter）和月形单胞菌属（Selenomonas）显著的富集在舍饲组（图3D）。舍饲山羊中甲烷短杆菌基因数量的增加，促使我们对参与氢营养型甲烷代谢通路的每一种酶的酶丰度进行检测（图3E），结果表明，与放牧组相比，舍饲组山羊瘤胃中参与氢营养型甲烷代谢通路的酶的所有基因显著富集，其中有6个酶的丰度显著不同（图3E）。

图3：放牧和舍饲山羊瘤胃微生物组成和代谢通路的差异。（a）基于16s rRNA基因测序数据分析放牧和舍饲山羊瘤胃内容物和粘膜组成的PCoA分析。（b）Methanobrevibacter和Alistipes丰度的差异。（c）放牧组和舍饲组甲烷代谢通路丰度差异。（d）优势菌属对甲烷代谢通路的相对贡献率。（e）氢营养型甲烷代谢通路中涉及的酶丰度差异。（f）基于山羊瘤胃微生物核心属的共生网络分析。仅列出top30个属。Spearman等级相关系数>0.50；p<0.05。不同的颜色代表瘤胃中不同的门。节点大小与属的相对丰度成正比，实线表示正相关，虚线表示负相关。线的粗细表示相关系数值的大小。（g）GH家族的遗传差异参与完全不同的纤维素降解途径。红色代表放牧山羊中瘤胃介导的纤维素降解途径，绿色代表舍饲山羊。

在放牧山羊中，Ruminococcus为积极促进瘤胃微生物中两个独立簇的核心属（图3F）。Treponema是一个竞争性抑制的核心属，与瘤胃中各菌属呈负相关关系（图3F）。与放牧组相比，舍饲组的瘤胃微生物共生网络更加独立和简单（连接的节点和边缘较少），而不像放牧山羊瘤胃中观察到的那样复杂（连接的节点和边缘较多）（图3F）。

由于反刍动物需要高效降解摄入的植物饲料可以有效消化的木质纤维素，以满足其能量需求，因此在两种条件下，对瘤胃中不同降解效率的CAZyme谱进行比较研究。在放牧山羊中，与植物细胞壁的降解有关的糖基水解酶家族GH3，GH2，GH78和GH9显著较高（图3G）。而GH77、GH23、GH13、G32和GH25家族在舍饲饲养的山羊中显著较高（图3G），它们参与淀粉和糖原降解，这些基因分别对应于编码α-淀粉酶（EC 3.2.1.1）、寡-α-葡萄糖苷酶（EC 3.2.1.10）和α-葡萄糖苷酶（EC 3.2.1.20），这些基因家族促进淀粉和糖原转化为糊精，利用EC3.2.1.10将分子进一步分解为D-葡萄糖，而EC 3.2.1.20促进麦芽糖转化为D-葡萄糖（图3G）。

4 放牧山羊与舍饲山羊后肠微生物群宏基因组序列分析

基于16S rRNA基因测序数据OTU水平的PCoA分析表明两种饲养条件下盲肠肠腔和粘膜的微生物组成存在显著差异。（ANOSIM，Bray–Curtis metric:R2=0.45，P=0.001）。具体而言，舍饲组盲肠内容物中Spirochaetes和Fibrobacteres相对丰度较高（P=0.03），而厚壁菌门（Firmicutes）相对丰度低于放牧组（P=0.03）。在盲肠粘膜中，螺旋体属（Spirochaetae）的比例占微生物总丰度的27%以上，但在肠腔中仅占约1.5%。进一步分析宏基因组数据，发现梭状芽孢杆菌属（Clostridium）、普雷沃菌属（Prevotella）和密螺旋体属（Treponema）在两组之间的比例显著不同（图4A）。KEGG功能分析的结果也表明了放牧山羊在群体感应、氨酰tRNA生物合成、肽聚糖生物合成、碳代谢、戊糖磷酸途径和丙酸代谢等代谢通路上显著富集，而这些通路参与翻译、复制和修复以及细胞过程（图4C和D）。与放牧组相比，舍饲组的氨基酸代谢相关途径更丰富（例如丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、氨基酸生物合成、精氨酸生物合成、乙醛酸和二羧酸代谢、脂肪酸生物合成、赖氨酸生物合成和脂肪酸代谢；图4C）。

图4：放牧和舍饲山羊后肠微生物组成、功能分布和ARGs表达。放牧和舍饲山羊（a）盲肠和（b）结肠核心属的丰度。（c）宏基因组测序揭示盲肠微生物功能通路的差异。（d）放牧和舍饲山羊盲肠的重要功能。（e）两组山羊胃肠道ARGs相对丰度。

另外有趣的是，与舍饲组相比，放牧组盲肠微生物互作共生网络更加独立和简单（连接的节点和边缘较少）。Ruminococus和Paenibacillus显示出正相关，并显示出相对独立和稳定的聚类。在舍饲组中，30个属之间存在着复杂的相关关系，在盲肠中形成了一个巨大的共生网络。Eubacterium和Butyrivibrio是重要的盲肠中重要的菌属，竞争性地抑制Phascolarctobacterium和Pararevotella的定植。

在结肠样品中观察到的核心菌互作模式与盲肠中发现的相似（图4B）。在放牧山羊中，Intestinimonas， Paenibacillus，unclassified_o_Clostridiales，unclassifiedf_Ruminococcaceae，Ruminiclostridium和Roseburia比例显著较高。放牧山羊结肠中丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢以及乙醛酸和二羧酸代谢高度富集。对结肠中CAZy家族的差异进行分析，发现在舍饲组中GT2、GT4、CE1、GH10、AA6、GH9和GH16显著富集，这些基因家族参与编码植物细胞壁降解的酶的合成，例如内切-1,4-β-木聚糖酶（EC 3.2.1.8），内切葡聚糖酶（EC3.2.1.4）和蔗糖合成酶（EC2.4.1.13）；而基因GH109、GH78、CE3、GH29、GH28、GH127和CE9在放牧组中显著富集，这些基因家族编码参与α-乙酰半乳糖苷酶、α-L-鼠李糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、α-L-岩藻糖苷酶、聚半乳糖醛酸酶、β-阿拉伯呋喃糖苷酶等酶和N-乙酰氨基葡萄糖6-磷酸脱乙酰酶的合成。

5 放牧与舍饲山羊前肠和后肠ARGs的差异

特别值得关注的是，放牧山羊和舍饲山羊瘤胃、盲肠和结肠的抗生素抗性类型的差异。PCoA结果显示了两种饲养系统下显著差异表达的抗生素类型。由试验结果可知，放牧组杆菌肽抗性基因水平显著高于舍饲组（P=0.01，图4E），而林可酰胺、四环素、大环内酯、头孢菌素和链霉素抗性基因水平在舍饲组瘤胃、盲肠和结肠中显著富集（图4E），在放牧组基本检测不到。

讨论

在本研究中，放牧组山羊经自由放养，并采食多年生牧草，而舍饲组山羊饲喂浓缩饲料。山羊日增重和肠道发酵模式的差异反映了与自由放牧山羊相比，舍饲饲料中能量与纤维比例更大。我们研究结果表明对舍饲山羊饲喂浓缩饲料增加了瘤胃中丙酸和丁酸的浓度，降低了乙酸的水平，这也与前人研究结果一致。SCFA发酵模式的改变促使舍饲动物的瘤胃pH值下降到5.04，根据前人研究这表明瘤胃酸中毒，是高性能反刍动物生产系统中的常见病理，其中可发酵纤维来源部分被简单碳水化合物底物（淀粉、单糖）取代，并且伴随全身炎症过程，与溶纤维细菌（例如：Ruminococcus flavefaciens，Ruminococcus albus和Pseudobutyrivibrio ruminis）减少和革兰氏阴性细菌（例如：Eubacterium和Anaerovibrio；Nagaraja和Titgemeyer）增加有关。这些研究结果与我们关于宏基因组测序结果一致，后者指出舍饲组与淀粉分解相关基因数量增加，而参与非淀粉多糖消化的基因减少。但是有意思的是，舍饲山羊无论是在采食行为，还是生长性能或视觉外观和行为方面均未有任何病理问题。这也表明这种亚急性水平的异常状况不一定会以明显或可测量的方式影响动物的性能。因此，这些参数不适合和有效地作为动物健康和性能状况的明确衡量标准。未来的研究应该在这类研究中定期筛查血液中的炎症标志物，以确定系统性炎症的发生。目前西藏山羊的标准舍饲饲养制度模仿了高性能牛的饲养方案，这是不同的反刍动物，有着不同的饮食偏好。因此，为了避免在未来损害动物的健康，动物营养研究必须开发专门为山羊设计的集约化饲养策略。

另外有研究表明，瘤胃中的产甲烷菌利用不同的底物，如氢、甲酸、甲基化合物和乙酸来产生甲烷。由于纤维素分解产生的乙酸盐易通过瘤胃壁吸收，因此在瘤胃中很少利用乙酸盐产生甲烷。因此，基于氢和二氧化碳作为底物的氢营养甲烷生成是动物消化道中最重要的产甲烷途径。在这种情况下，甲烷短杆菌（Methanobrevibacter）是氢营养型甲烷生成途径中最重要的产甲烷菌。瘤胃中甲烷的产生受多种因素的影响，例如消化道pH，饲料组成，采食水平，消化道微生物组成等，但主要取决于消化道内产氢和排氢的速率和途径。在传统的绵羊和山羊饲养过程中，瘤胃中的产甲烷菌和纤维素分解细菌很早就已建立。此外，产甲烷菌会影响产氢细菌和原生动物群落的数量，而产甲烷菌本身的数量受可溶性饮食碳水化合物（淀粉，糖）的影响。在本研究中，相对于放牧组，舍饲山羊瘤胃中甲烷生成途径相关基因显著富集，这与Methanobrevibacter数量较高有关。舍饲日粮中可发酵碳水化合物含量较高，而放牧山羊只能以青藏高原天然牧草为食，其所含能量和营养密度相对匮乏，这从山羊一周岁的体重较低可以反映出来。这似乎不仅会显著降低低生长性能，还导致微生物产甲烷所需的能源短缺。这是有道理的，因为氢营养甲烷生成途径中氢和二氧化碳的可用性取决于碳水化合物发酵生成挥发性脂肪酸的能力。我们已经讨论过，舍饲组瘤胃VFAs水平高于放牧组，这仅仅表明食草动物对可发酵碳水化合物的总摄入量较低。有研究表明，高淀粉摄取量以及由于淀粉酶降解菌增加丙酸量而导致的pH值下降有可能阻碍瘤胃甲烷生成。因此可推测，提供与舍饲日粮等量的可发酵碳水化合物，但淀粉含量低于非淀粉多糖的替代饲喂系统可能进一步增加了山羊瘤胃甲烷的生成。这些方面值得在未来的研究中给予更多关注，并且还应量化不同日粮饲养条件下山羊的甲烷排放。

先前的研究将肠道共生细菌分为四类：肠腔共生细菌、粘液细菌、上皮组织寄生细菌和淋巴组织寄生共生细菌。粘膜微生物已被证明可调节动物免疫功能，而腔内微生物则促进了通过胃肠道的大部分底物的发酵。先前的研究表明，粘膜群落是由宿主而不是由可利用底物形成的。在本研究中，盲肠粘膜群落在放牧和舍饲动物之间没有差异，换言之，肠粘膜微生物群来源于宿主选择，这种选择尤其发生在保护性粘液层的上皮附近，其覆盖在上皮上并包含防御分子，从而形成一个独特的粘膜相关微生物群落。总的来说，瘤胃黏膜相关微生物可以解释宿主遗传学对宏基因表达的大部分影响。我们的研究结果表明，与盲肠粘膜群落形成强烈对比的是，舍饲饲养导致盲肠腔内微生物群落更加多样和复杂，瘤胃内微生物群落更加独立和简单，而瘤胃酸中毒发生在舍饲山羊组。瘤胃酸中毒的经典观点是，饲料的快速发酵产生更多的乳酸、丙酸和丁酸，瘤胃pH值降至5.0，这导致纤维素分解细菌和产甲烷古细菌受到抑制，耐酸细菌增加。总的结果是瘤胃微生物群落的丰富度和多样性降低，这使得细菌之间的相互作用网络变得更加独立和简单。因此，我们推测舍饲山羊瘤胃内纤维降解不足增加了非淀粉多糖流入下肠段，从而导致盲肠和结肠微生物丰富度和多样性增加。这些假设需要在未来的实验中得到验证。

另外非常重要的观点是，放牧山羊瘤胃，盲肠和结肠内杆菌肽ARG的丰度增加，而其他类型抗性细菌基因的丰度较低（接近最低检测水平）。杆菌肽蛋白是微生物来源的高分子量多肽（Bacillus sp.）的混合物，通过干扰细菌细胞壁形成和肽聚糖合成而对革兰氏阳性微生物具有抗菌活性。先前的一项研究报告称杆菌肽除具有抗菌活性外，还可以中和多种病理相关的细菌毒素并保护培养的宿主细胞免于中毒，并且杆菌肽蛋白可能通过抑制其结合/转运亚基的基本膜转运功能来阻止pH介导的毒素的酶亚基跨过内体膜转运到靶细胞的细胞质中。有研究表明，日粮中添加杆菌肽可增加火鸡盲肠内吲哚3-乙酸、3-吲哚硫酸盐和5-羟基吲哚乙酸的含量，并减少吲哚-3-羧酸的含量，这些代谢物对宿主的营养利用，免疫状况和健康有着显著的积极影响。根据这些研究，我们得出结论，放牧山羊微生物组中杆菌肽ARG的上调代表了微生物适应恶劣环境条件的一种措施。与放牧的山羊相反，舍饲山羊的肠道微生物基因对多种特定类型的抗生素（包括四环素，大环内酯，头孢菌素和链霉素）具有抗性，且其基因含量要高得多（图5）。由于除了基础饮食，环境和圈舍外，所有动物均受到平等对待，因此我们怀疑饮食或环境因素促进了多种抗生素抗性基因的建立，而水平基因转移是抗生素抗性基因传播的重要方式，也是抗生素抗性基因对环境造成日益严重污染的原因之一，并且水平基因转移还有助于在舍饲动物中建立抗生素抗性。未来的研究应聚焦于可能会促进抗生素抗性的舍饲饲养系统中各种饮食和环境因素上，例如环境因素（光，温度和氧气）的变化影响了抗性基因在环境中的传播。

图5：不同饲养条件下瘤胃和后肠菌群组成和功能差异。（左）放牧显著增加瘤胃中Methanobrevibacter的含量，从而增强了氢营养型甲烷的产生途径，放牧显著增加了乙酸的合成，并且在放牧条件下Bacitracin抗性基因的比例显著增加。（右）舍饲饲喂显著增加了丙酸的合成，增强了四环素，大环内酯，头孢菌素等抗性基因的丰度，并增加了Rike_RC_9，Prevote_UCG_003和Prevotella的丰度。放牧显著增强了后肠中乙酸的合成，增强了Clostridium和Rumi_UCG_005的丰度，并增强了耐药基因Bacitracin的比例，从而增强了碳代谢和肽聚糖合成的途径，并显著提高了纤维素的降解通路。红色箭头表示放牧组明显增强；绿色箭头表示在舍饲组中显著增强。

结论

综上所述，本研究揭示了在具有挑战的环境和饮食条件下，半野生山羊胃肠道中微生物组的分类学和功能差异。结果表明，山羊的饲养条件和微生物甲烷生成相关基因的丰度之间存在很强的相关性。与放牧组山羊相比，舍饲环境有利于氢营养型甲烷代谢通路的增强以及瘤胃中产甲烷菌数量的增多（图5）。这反映了放牧饲养环境下由于营养成分的短缺，导致山羊对可发酵碳水化合物的摄入量显著减少，主要体现在一岁山羊体重的降低，并且伴随着动物生产性能的降低。此外，舍饲饲养使后肠微生物群落更加多样化和复杂，但瘤胃微生物群落更加独立和简单。杆菌肽ARG的增加被认为可以提高GIT微生物群对恶劣环境条件的适应能力。与舍饲山羊相比，放牧饲养模式下的杆菌肽ARG相对丰度较高。同时，舍饲山羊的消化系统含有更多编码四环素、大环内酯、头孢菌素和链霉素抗性的基因。未来的研究应该关注于如何通过更有益的膳食设计来刺激山羊的自然防御机制。综上所述，这项研究为揭示在极端条件下两种不同采食系统中山羊肠道微生物的分布和功能模式提供了新的见解。