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奥克拉荷马大学&清华大学 | SBB：新鲜和储存土壤样品的直接细胞提取：对微生物活力和群落组成的影响

2021

04/18

微生态

A-

A+

导读

从土壤样品中直接提取活微生物对于许多与单细胞相关的技术的应用至关重要。但是，提取技术有许多方面会影响新鲜或储存的土壤样品中可提取细胞的活力和多样性。在这项研究中，通过从四个具有不同理化特性的土壤样品中连续两次抽提细胞，优化了物理分散方法，化学分散方法和Nycodenz梯度培养基的浓度。细胞活力用荧光染色和流式细胞仪定量。在从死细胞中选择性去除DNA后，评估土壤可提取细胞和土壤样品中的微生物群落组成。在四种不同的提取和纯化方法中，物理混合和80％ Nycodenz离心的方案具有最高的细胞活力和产率。重复提取可提高产量，但会降低细胞活力。可提取细胞中微生物类群过高或不足可能影响提取微生物群落。使用优化的细胞提取程序，评估了土壤储存条件（4℃，-80℃和风干）对可提取细胞的产量，活力和群落组成的影响。在所有储存的土壤样品中，细胞活力均下降，但仅在风干的土壤样品中观察到细胞产量的显著下降。在所有储存的土壤样品中，微生物群落组成均发生了显著变化，在4℃下储存的土壤中观察到的变化最小，这证实了4℃短期储存适用于高效可行的细胞提取。综上所述，所开发的方法为推进我们对土壤微生物生态学和单个微生物的作用的分析和理解提供了巨大的潜力。

论文ID

原名：Direct cell extraction from fresh and stored soilsamples: Impact on microbial viability and community compositions

译名：新鲜和储存土壤样品的直接细胞提取：对微生物活力和群落组成的影响

期刊：Soil Biology and Biochemistry

IF：5.795

发表时间：2021.2

通讯作者：Aifen Zhou，Jizhong Zhou（周集中）

通讯作者单位：美国奥克拉荷马大学；清华大学

试验设计

从四川省的地点收集了四种表层土壤（深度为0-10厘米）。俄克拉荷马州（表1）。土壤A是从2009年新建的变暖实验区外部获取的一块壤土。土壤B是从1999年创建的实验区外部获取的黏土壤土。土壤C（砂壤土）和土壤D（壤土）。将每种土壤样品均质化，并在提取细胞之前在4℃下保存少于两天。为了评估土壤贮藏条件对细胞活力和微生物群落组成的影响，将等分试样（约200 g）的土壤样品分别在4℃，-80℃或室温下风干。细胞提取前35天，要解冻-80℃时存储的土壤样品，将土壤样品在20℃保存1天，在4℃保存1天。使用脱氧胆酸钠（SD，水中0.1％）或Tween 20（T20，PBS缓冲液中0.5％）进行化学分散。测试了两种Nycodenz浓度分别为80％和90％（在水中w/v）。收集原始土壤样品和提取的细胞用于DNA提取，PCR和扩增子测序。总体实验过程如图1所示。

使用搅拌机将土壤进行物理分散。在Nycodenz纯化之前，将土壤浆液保持在冰上。分散后，将土壤浆液离心。离心后，收集Nycodenz上方含有细胞的层，土壤提取的细胞通过离心沉淀。丢弃上清液，并将细胞沉淀重悬于5 ml PBS缓冲液中，并命名为“ 1st CELL”。将来自第一轮Nycodenz纯化的土壤沉淀物重新悬浮在每个试管中的20 ml SD或T20中。第一次细胞提取后，将来自三个重复样品的所得浆料合并在一起进行混合。再次分散土壤浆液以进行第二轮土壤细胞的提取和纯化。在这一轮中收获的细胞被称为“2nd CELL”。为了通过涡旋进行物理分散，分别加入15 g的土壤和30 ml的SD 加入50毫升离心管中。然后将泥浆以最高速度涡旋振荡15分钟。涡旋后，在无菌的Oak Ridge离心管中将20 ml土壤浆液缓慢添加到18 ml 80％ Nycodenz的顶部，离心40 min，如上所述收集土壤细胞。如上所述进行了两轮细胞提取。每个土壤样品重复三次。SYBR Green I和碘化丙锭（PI）染色用于区分活的和死的土壤可提取细胞。单叠氮化丙锭（PMA）用于从没有完整膜的细胞中去除DNA。最后进行土壤DNA提取及高通量扩增子测序

表1 试验土壤理化性质。缩写:SOC，土壤有机碳;TN，总氮。

图1土壤细胞提取过程的流程图。A）分散。物理分散（涡旋和共混）和化学分散（脱氧胆酸钠和Tween 20）。B）Nycodenz纯化。将分散后的土壤浆液缓慢添加到80％或90％（w/v）Nycodenz。C）进行第二轮连续提取。D）使用PBS缓冲液洗涤提取的细胞，并用无菌过滤器（30μm孔径）过滤。E）使用SYBR Green I和碘化丙锭对提取的细胞染色，然后使用流式细胞仪进行定量。F）单叠氮化丙锭（PMA）用于从死细胞中除去DNA。进行DNA提取和高通量测序。

结果

1 确定土壤中微生物细胞提取的最佳方案

我们使用以下方法评估了土壤可提取细胞的产量和生存力：物理分散度，化学分散度和Nycodenz浓度的四种萃取组合。所有提取均在不同类型的土壤（包括壤土，沙质壤土和黏土壤土）中进行两次连续的提取（图1）（表1）。经过两轮提取和纯化，土壤可提取细胞的总产量为4.5×10⁶至2.6×10⁷/g（图2A）。总体而言，在四个测试土壤中，第一轮提取（占总细胞的55-80％）比第二轮提取（占总细胞的20-45％）回收的可提取细胞更多。将细胞存活率计算为活细胞数在细胞总数中的百分比。与2nd CELL相比，1st CELL获得较高的细胞活力（图2B）。在四种测试土壤中，1st CELL的细胞活力范围为42％至75％，2nd CELL的细胞活力范围为25％至61％（图2B）。在物理分散方面，共混比涡旋回收了更多的总细胞和可行的可提取细胞。与Tween 20（T20，0.5％的PBS缓冲液）进行化学分散相比，土壤可提取细胞的收率明显高于脱氧胆酸钠（SD，0.1％）。Nycodenz浓度从80％增加到90％对土壤可提取细胞的产量和活力影响不大（图2）。VSN80的组合（涡流+ SD + 80％的Nycodenz）的活力最低，而BTN80的组合（掺混+ T20 + 80％的Nycodenz）的活力最高（图2B）。考虑到细胞活力和产量，结果表明BTN80是土壤中提取细菌细胞的最佳组合。

图2 物理和化学分散以及Nycodenz浓度的不同组合下的土壤可提取细胞的产量（A）和生存力（B），以及细胞提取和纯化的两个连续轮次。用SYBR Green I和碘化丙锭通过活/死染色细胞的流式细胞术定量活力。使用方差分析测试了不同提取组合之间可提取细胞总产量差异的意义（p <0.05）。星号表示1st和2nd CELL之间的细胞活力有显著差异（*p <0.05，**p <0.01，***p <0.001）。SD：脱氧胆酸钠。

2 土壤提取细胞的微生物群落组成与原始土壤有显著差异

使用16S rRNA扩增子序列分析原始土壤样品和土壤提取细胞中的微生物群落组成，以评估土壤提取的细胞是否代表原始土壤微生物群落的多样性。无论采用何种细胞提取程序，提取细胞（1st CELL和2nd CELL）中的微生物群落组成均与原始土壤样品中的微生物群落组成显著不同（图3，p <0.001）。总体而言，在原始土壤样品中，通过搅拌器和T20分散的细胞的微生物群落组成与群落更紧密地聚集在一起，尤其是在土壤C（砂壤土）的情况下。此外，1st CELL和2nd CELL具有不同的微生物群落组成（p <0.001）。总体而言，土壤样品中的微生物富集度（观察到的OTU）没有差异，而与1st CELL或2nd CELL无关（图S3）。在2nd CELL样品中，VSN80方法的富集度最低。正如预期的那样，PMA处理（从没有完整膜的细胞中去除DNA）导致微生物群落与原始土壤样品（p = 0.002）和提取的细胞（p <0.001）明显不同，表明存在没有完整膜的细胞在土壤和提取的细胞中（图3和图S4）。在原始土壤样品中，PMA处理对丰富度（图S3中的新鲜土壤，p = 0.83）和丰富的分类单元的相对丰度（> 1％）没有显著影响。相反，在提取的细胞中，PMA处理显著降低了1st CELL和2nd CELL的富集度（图S3，p <0.001），

图3不同提取方法对土壤或土壤可提取细胞中微生物群落UniFrac距离的非度量多维标度（NMDS）排序。左图：未经单叠氮化丙锭（PMA）处理。右图：经过PMA处理。PERMANOVA表示PMA，细胞组分和提取组合的显著差异性（p <0.001）。

3 土壤可提取细胞中代表性微生物类群

在所有实验条件下，在原始土壤样品和可提取细胞中观察到了（经PMA处理）和整个微生物群落组成之间的显著差异（p = 0.002，PERMANOVA）（图S4）。在门的水平上，无论如何采用PMA处理，土壤可提取细胞中关键细菌门的相对丰度与原始土壤样品的相对丰度都存在显著差异（图S5）。同样，在门的水平上，可行的群落通常显示出Actinobacteria增加，但土壤可提取细胞中的Acidobacteria丰度降低（图S5）。我们进一步分析了门和属水平上的可行微生物群落，以揭示土壤中可提取细胞与总细胞之间差异的来源。比较土壤和通过BTN80方法最佳组合提取的细胞的微生物群落，在菌群水平上，从提取的细胞中回收了土壤中所有丰富的菌群（相对丰度> 1％，总共13个菌群）。仅在提取的细胞群中观察到三个丰富的门，包括Chlamydiae（在所有四种土壤中），Armatimonadetes（在土壤D中）和Parcubacteria（在土壤C中），表明在可提取的细胞中某些门的可检测性提高了。此外，在总细胞群和可提取细胞群中均发现了6个丰富的门，但其跳动现象却大不相同（图4和图S5）。相对丰度在1st CELL中最高。与土壤相比，1st CELL中Actinobacteria和Verrucomicrobia的丰度通常较低，而2nd CELL中较高。在提取的细胞群体中，包括Acidobacteria, Bacteroidetes,和 Firmicutes的三种门均不足。在这里，与所有三个门的总土壤种群相比，1st CELL和2nd CELL的相对丰度都较低。在属水平上，提取的细胞群体中缺少许多属。我们关注于在四个土壤中相对丰度> 0.1％的丰富属。在丰富的属中，有13个属被认为是“难以提取”的类群，因为它们存在于土壤样品中，但不存在于从至少三个土壤样品中提取的细胞中。这些微生物大多数属于Bacteroidetes, Firmicutes, 和 Proteobacteria（表2）。

图4 活的可提取细胞中几种细菌门的相对丰度（> 1％）与原始土壤样品相比有显著差异（p <0.05，ANOVA）。使用PMA从死亡细胞中去除DNA。使用Blender + T20 + 80％Nycodenz的组合提取土壤细胞。小写字母表示特定土壤样品中土壤和细胞之间的显著差异。

表2 土壤样品中难以提取的属的相对丰度（％）。难以提取的属定义为存在于总土壤DNA提取物中的属，但在至少三个土壤样品中的相对丰度截止值为0.1％的提取细胞的DNA中不存在。ND表示特定土壤样品中没有该属。*表示在提取的细胞中检测到属。SOM，土壤有机质。

4 土壤贮藏条件对土壤提取细胞产量和活力的影响

使用优化的细胞提取程序（BTN80），我们评估了土壤储存条件（4℃，-80℃和风干）对可提取土壤细胞的产量和生存能力的影响。与新鲜土壤相比，在4℃或-80℃下储存对总提取细胞的产量没有影响（图5A），而在室温下风干则明显降低了产量。在所有储存条件下，1st CELL的活力均下降（图5B），但在4℃储存条件下，其活力下降最小（与新鲜土壤相比下降8.8-18％）。对于2nd CELL，新鲜土壤和4°C储存的土壤之间没有显著差异。然而，在-80℃储存或风干的土壤样品中观察到细胞活力显著降低。两者合计，由于细胞死亡，土壤可提取细胞的活力对土壤储存条件更为敏感。考虑到细胞产量和活力，确定4℃是储存土壤样品的最佳条件，-80℃是第二选择，不建议风干进行活细胞的提取和分离。

图5 储存条件对从四种不同土壤样品中提取的细胞的产量（A）和生存力（B）的影响。使用Blender + T20 + 80％Nycodenz的组合进行了两轮连续的细胞提取。SYBR Green I和碘化丙锭染色用于区分活细胞和死细胞。差异的显著性用ANOVA检验（p <0.05）。误差棒代表标准偏差（n = 3）。小写字母和大写字母（B）分别表示1st CELL和2nd CELL的存储条件之间的显著差异。

5 贮藏条件改变了土壤和土壤提取细胞的微生物群落组成

土壤和土壤可提取细胞的活菌总数和总微生物群落组成都在三种储存条件下发生了显著变化（图6和图S6，p <0.001）。空气干燥比在4°C或-80°C下的储存效果更强。总体而言，存储在4℃的土壤样品中的微生物群落组成更紧密地聚集在一起。此外，在三种储存条件下，与新鲜土壤相比，土壤和提取细胞中总的微生物群落和存活的微生物群落的丰富度均下降（图S7）。风干样品通常在土壤中的富集度最低，并且1st CELL含量最低。在三种储存条件下第二细胞的丰富度没有差异。与总微生物群落相比，存活的微生物群落对储存条件更为敏感（图6和S5）。与新鲜土壤相似，PMA处理在不同储存条件下对总土壤种群（p <0.001）和提取的细胞种群（p <0.001）的微生物群落组成有显著影响（图6）。此外，用PMA处理的样品在冷冻和风干的样品（图S7）中显示出显著（p <0.001）较低的微生物富集度。然后分析了在门和OTU水平上的可行微生物群落组成，以发现源自土壤贮藏年龄条件的差异。就土壤样品的微生物群落而言，丰富的门总体上未显示新鲜土壤与4℃下储存的土壤之间的差异。但是，在冷冻或风干的土壤样品中，几种细菌门的相对丰度显示出显著变化（p <0.05）。例如，Proteobacteria, Acidobacteria, Bacteroidetes,和 Verrucomicrobia的相对丰度通常显著较低，而Actinobacteria 和 Firmicutes的相对丰度通常较高。样品在-80ºC或空气干燥的条件下比在新鲜土壤或4ºC的土壤中存储的方法更胜一筹（图7A）。同样，在OTU水平上，与在-80℃或空气干燥条件下储存的土壤相比，在4℃下储存的土壤样品中观察到的响应性OTU较少（图7B）。大多数响应式OTU，定义为相对OTU丰度的显著变化，在-80°C的温度下存放或风干时， Proteobacteria, Acidobacteria,Actinobacteria, Bacteroidete, 和 Verrucomicrobia.微生物群落组成发生了显著变化。在1st CELL中，除了土壤C和D中Acidobacteria的相对丰度降低和Actinobacteria的相对丰度增加外，大多数丰富的门（> 1％）在新鲜土壤和4℃下储存的土壤之间没有差异。在4个土壤样本中，在4℃下储存的1st CELL中，在Proteobacteria中发现了700多个响应性OTU，尽管该门没有显示出差异（图S8B）。与总的土壤微生物群落相似，Proteobacteria和Acidobacteria的相对丰度显著下降，而从储存-80℃或风干的土壤样品中提取的1st CELL中的放线菌增加了（图S8A）。大多数响应式OTU都在这三种门都属于80°C的储藏或风干（图S8B）。尽管在门类水平上的差异有限，但是我们获得的响应性OTU比原始土壤样品的响应性更高，这表明这些提取的细胞对土壤存储更敏感。在2nd CELL中，从风干土壤样品中提取的门的相对丰度存在较大差异。Proteobacteria和Verrucomicrobia丰度降低，而Actinobacteria和Firmicutes在从储存于-80℃或风干的土壤样品中提取的2nd CELL中的丰度增加了（图S9A）。同样，在存储条件下，大多数响应性OTU都位于这四个门中（图S9B）。

图6 新鲜和储存的土壤样品中经过或未经过PMA处理的土壤细菌和土壤可提取细菌中微生物群落的非度量多维标度（NMDS）排序。

图7（A）新鲜和储存的土壤样品中几种活菌门的相对丰度（> 1％）显著不同。差异的显著性用ANOVA检验（p <0.05）。（B）与相应的新鲜土壤样品相比，储存的土壤样品中OTU的相对丰度变化（log2倍变化）。每个圆圈代表单个OTU，调整后的p值<0.1。

讨论

从土壤中提取微生物细胞是应用于发现微生物活动的关键步骤。例如，已经广泛挖掘了土壤中的微生物多样性，以发现新型抗生素，抗癌化合物，酶和生物关于提取方法的先前工作通常集中于以细胞总数而不是活细胞总数评估的细胞回收效率的提高。在这项研究中，我们研究了提取程序和土壤存储条件如何影响生存能力和微生物群落。使用不同土壤类型（壤土，沙质壤土和黏土壤土）的四种土壤样品提取细胞的组成。在试验条件下，土壤细胞提取方法的最佳组合，即使用搅拌器+ Tween 20 + 80％ Nycodenz，具有最高的细胞活力和产量。重复的细胞提取可以提高总体细胞产量，但是在第二轮从土壤中提取细胞的过程中，其生存能力可能会受到损害。在-80℃的温度下储存土壤样品或风干会显著降低细胞活力和/或产量。我们的结果表明，在本研究中测试的所有条件下，提取的总细胞与提取的总活细胞之间存在显著差异，并且对于某些微生物学应用，着重于活细胞提取而不是总细胞是至关重要的。

我们对提取程序的测试证明了离子缓冲剂和非离子缓冲剂的组合以及重复提取的积极作用，但Nycodenz浓度的增加并未提高细胞产量。在物理分散方面，我们发现混合比涡旋具有更高的细胞产率和活力。尽管混合是一个苛刻的分散过程，但在间隔之间在冰上孵育三分钟（短时间）和一分钟，可能有助于维持细胞活力。相反，在室温下连续15分钟涡旋可能会破坏细胞完整性。化学分散是否能提高细胞产量仍存在争议。与六种离子或非离子缓冲剂相比，它是适用于多种土壤质地的最佳缓冲剂。在我们的研究中，离子缓冲液和非离子缓冲液的组合（PBS缓冲液中的Tween 20）比SD产生的细胞产量和活力显著更高，这表明缓冲液可能破坏不同形式的微生物附着在土壤颗粒上。重复提取对土壤中可提取细胞总数的贡献很大（高出20％至40％）。这一发现与先前关于重复提取细胞的高回收率的研究一致。但是，应该注意的是，重复提取是费时的，而且更重要的是，它显著降低了细胞的活力。细胞活力的降低可能归因于重复的体力劳动所造成的损害分散，或在第二轮细胞提取中回收受损的膜完整性的细胞。我们的结果不支持Nycodenz浓度增加可以提高细胞产量的假设。植物密度细胞的浓度通常在1.11至1.20 g/ml之间。80％的Nycodenz具有约1.426 g/ml的密度，其密度足以回收大多数营养细胞。

对微生物群落组成的分析表明，经过两轮混合和T20分散然后Nycodenz纯化的土壤可提取细胞土壤微生物群落比其他测试组合更好。在每种细胞提取方法组合和每一轮提取中回收了不同的微生物群落，这表明每种物理和化学分散以及每一轮提取对某些微生物组都是有效的。为了回收更好地代表土壤样品中原始微生物群落的微生物细胞，建议使用多种物理和化学分散组合。1st CELL和2nd CELL的组合可能更好地代表了原始的土壤微生物群落。与原始土壤相比，土壤提取细胞的微生物群落偏向的原因被认为通常由Proteobacteria, Acidobacteria,和 Verrucomicrobia.代表，而在细胞中Actinobacteria和Firmicutes代表不足。这些结果进一步强调了重复细胞提取在恢复与土壤微生物群落相似的土壤微生物群落中的重要性。

土壤原核生物包括几类难于提取的微生物，包括能形成孢子，细胞呈丝状，产生细胞外化合物和形成生物膜的微生物。例如，Virgisporangium，Sporosarcina和Tumebacillus（表1）是孢子形成体。由于这些孢子的密度可能高于Nycodenz，因此某些孢子可能无法通过Nycodenz密度离心法提取。这些大多数很难提取Bacteroidetes属于Chitinophagaceae。这些微生物可以牢固地附着在几丁质颗粒上，以降解几丁质或其他土壤有机质。在这之中 Niastella和Solitalea组具有丝状细胞形状。它们与土壤有机物和颗粒的紧密结合可能使它们更难提取。虽然变形菌门的比例过高，但5个比较丰富的属在提取的细胞中并没有发现。这些属中的大多数具有生物膜的生活方式并形成细胞聚集物。因此，使用密度比Nycodenz更高的密度梯度培养基可能有助于这些细胞的提取。为了恢复难以提取的属，我们建议在第一轮细胞提取中使用优化的物理和化学分散体来回收最易提取的物质。然后，在第二次实验中，可以使用更强的去污剂和消化酶来分散紧密附着的细胞。在第三轮提取中，可使用溴化钠（NaBr）密度梯度离心法提取孢子。立即从新鲜土壤中提取细胞是研究其微生物群落组成和功能的理想选择。但是，由于许多原因，通常无法立即处理土壤，包括需要测试的大量土壤样品，从现场到实验室的运输要求，以及从中提取细胞后难以保持细胞存活的原因。从新鲜和储存的土壤样品中分析可行的微生物群落提供了土壤贮藏条件对土壤可提取细胞活力的影响的证据。我们的分析表明，由于储存条件的改变，土壤微生物的总数和存活率都发生了变化。根据我们的分析，建议在4℃下短期储存，因为与新鲜土壤相比，仅观察到微生物群落组成和可提取细胞产量的微小变化。相反，在-80℃或风干后储存会产生明显的负面影响。对细胞活力和群落组成的影响。其他研究也表明，冷冻和风干会显著改变微生物的生物量和群落组成。