文献精读 | 长期慢性社交压力损伤血脑屏障促使抑郁发展

    心血管疾患者患有重度抑郁症（Major depressive disorder, MDD）的概率要比非心血管疾病的患者高出2 - 3倍，相应的，MDD患者中心血管疾病的患病率和死亡率相比于非MDD患者增加了80%左右。临床研究报道称MDD患者循环中存在高水平的促炎因子，然而后者与动脉粥样硬化斑块的形成、进展和破裂有关。

    患者外周免疫系统中炎症因子的释放（例如IL-6）与个体应对社交压力时的反应程度相关（易感或耐受）。有研究认为，由于压力诱发神经血管损伤和血脑屏障通透性增加会导致外周炎性细胞或促炎因子进入机体脑内。血脑屏障是由毛细血管内皮细胞以及细胞间紧密连接、星形胶质细胞终足、基膜和周细胞共同组成的一个细胞复合体，能够防止循环血液中的有害物质入脑。其中Claudin 5 (Cldn5)在血脑屏障中内皮细胞之间的紧密连接起了重要作用，Cldn5缺失导致血脑屏障通透性增高。本研究通过慢性社会挫败 (chronic social defeat stress, CSDS)模型，探索抑郁状态对血脑屏障有关基因表达的影响，并明确了Cldn5在抑郁样行为和MDD发展中的作用。

    长期的社会压力是导致情绪紊乱和自杀的主要因素。同样在啮齿类动物中，CSDS使小鼠出现类似抑郁的表型(社交回避、快感缺乏)。在CSDS训练过程中，一只雄性C57BL/6 J小鼠每天(10分钟/天)和一只体型更大、具有攻击性的CD-1小鼠有身体接触，被打败的小鼠从而表现为社交挫败（Fig.1a）。挫败小鼠随之进行社交互动（SI）测试，表现为社交回避者称为压力易感型小鼠（SS）, 不表现社交回避者就称为压力耐受型小鼠（RES）。通过比较SS组和RES组小鼠来探究慢性应激反应对神经血管（血脑屏障）的影响和相关机制。在进行10天CSDS训练后，研究者首先对应激对照组(CTRL)、SS组和RES组小鼠伏隔核(NAc)中血脑屏障相关蛋白、细胞因子和趋化因子的基因表达转录谱进行分析(Fig.1b)，发现CSDS训练使NAc中内皮细胞生物学、血管生成、血管通透性以及血脑屏障形成和功能相关基因表达发生了改变(Fig.1b)。值得注意的是，与CTRL组和RES组小鼠相比，SS组小鼠伏隔核中Cldn5 mRNA水平显著下降，且mRNA水平与社会回避行为呈正相关(P = 0.0014) (Fig.1c-e)。免疫荧光同样发现SS组小鼠中Cldn5蛋白也出现特异性降低(Fig.1f)。

     电镜下，SS组小鼠NAc血管内皮细胞间出现异常非连续的紧密连接(P<0.0001) (Fig.1i)，而该现象并未在RES组小鼠中观察到。当连续35天给予SS组小鼠丙咪嗪以逆转抑郁相关症状后，发现SS组小鼠在给药后的社交回避表型得以恢复(Fig.1h)，并且NAc中Cldn5 mRNA表达也恢复正常(Fig.1h)。

    为了检测实际临床中伏隔核CLDN5的表达缺失是否与MDD相关，研究者通过两个独立收集的MDD患者的队列样本，一个来自麦吉尔大学，另一个来自德克萨斯大学西南医学中心，在患者死亡后检测伏隔核中CLDN5 mRNA的表达水平。根据毒理学报告，每个队列中约有一半的MDD受试者在死亡时正在服用抗抑郁药物。在蒙特利尔队列中，未用药的MDD患者伏隔核中CLDN5 mRNA表达水平与健康对照组相比，显著降低(P=0.0117)，服用药物后仅有轻微改善（Fig.1j）；在德克萨斯大学的研究队列中，MDD患者与健康对照组相比CLDN5 mRNA水平同样显著降低(P = 0.0435)，但药物治疗组患者却未发现变化（Fig.1j）。

▲ Fig.1

    为了证实Cldn5表达缺失与社会压力诱导的抑郁样行为存在因果关系，研究者在小鼠NAc中条件性敲除Cldn5基因以进行功能学研究，利用立体定位注射技术向NAc注射AAV-shRNA-Cldn5，诱导Cldn5 mRNA表达水平 (P=0.0016)(Fig.2b)和蛋白表达水平(P=0.0013)显著下调(Fig.2c)。

    AAV-shRNA-Cldn5注射后小鼠进行阈值下微小挫败训练(Fig.2a)后观察到，Cldn5表达缺失后诱发了小鼠出现类似抑郁的行为(Fig.2d-g)。但当恢复AAV-shRNA-Cldn5组小鼠Cldn5表达时(Fig.2h)，相关行为学实验结果被逆转(Fig.2j),小鼠行为恢复正常。根据以上结果，研究者推测Cldn5可能通过维持血脑屏障的稳定性在应激行为反应中起到脑保护作用。

▲ Fig.2

   在以上实验结果中观察到CSDS诱导后Cldn5缺失和SS组小鼠血管形态的改变，研究者使用钆造影剂(Gd-DTPA, 0.7 kDa)和磁共振成像扫描比较了CTRL、SS和RES三组小鼠在10天CSDS训练后血脑屏障的完整性（Fig.3a）。与CTRL组和RES组小鼠相比，SS组小鼠的伏隔核 (P=0.0237)和海马(P=0.0085)中检测到了更高的Gd-DTPA信号(Fig.3b)，提示这些脑区BBB存在渗漏，并且小鼠出现社交回避行为也与NAc和海马中的Gd-DTPA水平显著相关(Fig.3b,c)。在使用另一种分子量为0.95 kDa的染料——Alexa Fluor-555时，再次证实了应激诱导的SS组小鼠伏隔核(P=0.0022)(Fig. 3d,e)和海马区BBB渗漏，且Alexa Fluor-555的积聚程度与社交回避行为显著相关。Evans Blue（EB）染料由于能与血清白蛋白紧密结合形成分子复合物(Fig.3e)，常被用来检测BBB的完整性。生理情况下，血清白蛋白无法穿过血脑屏障。但在SS组小鼠的伏隔核中EB浸润却显著增加(P = 0.0014)(Fig.3e)，但主要积聚在伏隔核的血管周围空间，而不是脑实质内(Fig.3e)。在给予成年小鼠伏隔核内注射AAV-shRNA-Cldn5后，发现Alexa Fluor-555或者EB注射均可观察到血脑屏障的渗漏(Fig.3f-h)。电镜下观察到SS组小鼠中辣根过氧化物酶(HRP, ∼44kDa)摄取也增加(P=0.0008)(Fig.3i)。综上所述，SS组小鼠血脑屏障完整性受损，伴随着Cldn5的缺失和血管超微结构异常。

▲ Fig.3 

    在前人的研究中，对于社交压力是否会引起外周免疫细胞进入大脑实质中有较大的争议。本研究通过CSDS模型小鼠，检测外周CCR2+(C-C chemokine receptor 2)细胞是否进入了脑实质中。在Fig.1结果表明进行CSDS训练10 天后SI测试中社交失败的动物伏隔核中细胞因子和趋化因子mRNA表达的剧烈变化(Fig.1b,c)，SS组小鼠中Ccr2表达显著增加(P<0.0001)，而Ccr2与社会回避行为相关。为了观察外周CCR2+单核细胞是否进入脑实质，研究者使用了Ccr2 RFP::Cx3cr1 GFP双杂合子小鼠，该种小鼠脑实质中小胶质细胞为Cx3cr1+Ccr2-，表达绿色荧光蛋白；而外周单核细胞为Ccr2+Cx3cr1-，表达红色荧光蛋白。若外周单核细胞在炎症过程中被激活并招募入脑内，则脑实质内同时存在绿色的小胶质细胞和红色的单核细胞，若单核细胞并未进入脑实质内，则脑实质内仅有绿色的小胶质细胞，红色的单核细胞存在于脑血管中。研究者给予Ccr2 RFP::Cx3cr1 GFP小鼠CSDS训练后并进行了SI测试(Fig.4a)。与无压力对照组相比，应激小鼠表现出社交回避(P=0.0103)(Fig.4b)。通过流式细胞术检测中发现应激小鼠脑中出现了更多红色的Ccr2+外周单核细胞(Fig 4c),但绿色 Cx3cr1+小胶质细胞并没有变化。进一步免疫荧光检测观察，外周血中的单核细胞聚集在脑室内和伏隔核血管中，并未浸润到脑实质。

     接下来，研究者探究了血液循环中炎症因子IL-6（与MDD相关的促炎因子，约21 kDa)，是否能在社交挫败的小鼠伏隔核内被检测到。研究者的前期结果中发现SS组小鼠社交挫败后20分钟，循环中IL-6水平增高27倍。基线IL-6水平在应激前未见差异，最后一次挫败后48小时IL-6水平仍然增高。因此在CSDS训练后，研究者首先确认了SS组小鼠血浆和伏隔核中IL-6蛋白高于CTRL组(P=0.0321)(Fig.4d)，但这并不能排除应激诱导IL-6在局部产生的可能性。为确认外周IL-6是否能进入大脑实质，研究者将小鼠IL-6与生物素(约0.45 kDa)重组，通过眶后注射进入血液循环（Fig.4g）。两小时后灌注取脑检测，仅在SS组小鼠的NAc中发现了重组IL-6，而CTRL组小鼠伏隔核中并未检测到(Fig.4g)。在给予小鼠AAV-shRNA注射下调Cldn5的表达后，重组IL-6在伏隔核实质可被观察到(Fig. 4h)。为了证实伏隔核 IL-6在建立抑郁样行为中的重要性，研究者在小鼠伏隔核中置入套管，并在阈值下微小挫败训练前给予盐水或IL-6(Fig.4f)。与接受盐水相比，接受IL-6应激小鼠表现出更多的社会回避（Fig.4f）。这些观察结果表明，社交挫败导致IL-6直接通过伏隔核，然后作用于伏隔核，诱导抑郁样行为。

▲ Fig.4 

    长期慢性社交压力通过下调伏隔核中的紧密连接蛋白Cldn5表达，联合应激诱导的外周免疫相关信号共同导致了血脑屏障通透性增加，进而使得血液循环中IL-6通过血脑屏障，最终诱导抑郁样行为。