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轻重链错配？双特异抗体技术平台中的Linker策略

2021

04/21

BiG生物创新社

A-

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双特异抗体设计最重要的一点就是如何提高抗体的正确组装，减少抗体链间的错配。目前已经有多种方法用于防止双特异抗体的错配，今天总结一下linker在防止双特异抗体错配中的作用。

OAscFab-IgG

OAscFab-IgG技术由Roche团队开发，抗体的设计主要是通过(G4S)6GG 32个氨基酸的linker连接。Linker从一个抗体的重链N端开始，然后连接在抗体轻链的C端，从而促使抗体的轻链与对应的重链错配。该linker是不可去除linker。

图1：OAscFab-IgG双特异抗体平台

LUZ-Y

LUZ-Y技术由礼来团队发明，其主要是利用Acid.p1 (Ap1) 和 Base.p1 (Bp1)可以形成平行的异源二聚体，将两端肽分别添加在抗体重链的C末端，表达后通过Ap1和Bp1相互作用增加异源二聚体的含量。为了切除亮氨酸拉链结构，在抗体的C末端和亮氨酸拉链的N末端引入赖氨酰肽链内切酶切位点（图2中正常抗体末端处），同时为了防止抗体轻链错配，在同一个抗体VH和CL中间引入GGGS连接子（图2中的黑线）。

而且该设计通过引入弗林蛋白酶切位点可以将连接子除去（图2中红色短线为弗林酶切位点）。

图2：LUZ-Y双特异抗体平台

tcBsIgG（tethered-variableCL BsIgG）

tcBsIgG技术平台由Genentech团队开发，该技术主要是将抗体轻链的可变区通过G4S连接子与抗体的重链可变区相连接（图3），表达后抗体的轻链可变区与重链可变区相互结合，从而达到防止轻链错误配对（重链主要靠Knob-In-Hole技术防止错误配对）。

同时，抗体的轻链恒定区CL与改造后的两条重链共表达，CL靠分子间作用力与抗体重链的CH1相互结合并形成稳定的二硫键。

图3：tcBsIgG双特异抗体平台

LegoBody

LegoBody的设计中主要应用了凝血酶（Thrombin），该酶切割序列专一性强，水解效率高，被广泛用于切割标签。为了防止抗体轻链的错配，将抗体的轻链通过linker与对应的抗体重链相连接，该linker的在轻链的C端和重链的N端都加入可以被凝血酶水解的序列，当抗体纯化后，利用凝血酶将linker切割，从而形成不含linker的双特异抗体。

图4：LegoBody构建的多特异抗体

总结

目前小编已知的双特异抗体平台中，这四种用到linker的平台都是用来防止抗体重链和轻链的错配。其中LUZ-Y和LegoBody两种平台中Linker可以通过后期的酶切处理进行移除。

LUZ-Y主要通过弗林蛋白酶和羧肽酶B除去linker及残留氨基酸，但是需要在重链铰链区222位引入一个点突变K222A（防止酶非特异性切割）。LegoBody主要通过凝血酶将linker移除，但是会有氨基酸残留。而tcBsIgG和OAscFab-IgG平台中的linker为抗体的一部分，无法通过后期技术移除。

参考文献

1、Hok Seon Kim et al .Tethered-variableCL bispecific IgG: an antibody platform for rapidbispecific antibody screening.Protein Engineering 2016

2、Juergen M. Schanzer,Katharina Wartha, Rebecca Croasdale et al. A Novel Glycoengineered BispecificAntibody Format for Targeted Inhibition of Epidermal Growth Factor Receptor(EGFR)and Insulin-like Growth Factor Receptor Type I (IGF-1R) Demonstrating UniqueMolecular Properties

3、Shanshan Lang, Su Yang,Scott Bidlingmaier et al.LegoBody: facile generation ofbispecific and multi-specific antibodies. 2019