含pyrin结构域NOD样受体家族3炎性小体的翻译后修饰及其在脓毒症发生发展中的作用

【综述】

脓毒症系以感染后器官障碍为特征并危及生命的综合征[1]。多项研究发现，含pyrin结构域NOD样受体家族3（NOD‑like receptors family pyrin domain containing 3, NLRP3）炎性小体在脓毒症的发生、发展中发挥了重要作用，越来越多的研究将NLRP3作为脓毒症治疗的靶点，例如抑制NLRP3炎性小体的激活可以抑制小鼠脓毒症并降低其死亡率[2‑3]、敲低NLRP3基因能够显著减少肝内促炎细胞因子的水平并减轻脓毒性肝损伤[4]。近年研究发现，NLRP3炎性小体的翻译后修饰（post‑translational modification, PTM）是其炎症信号的主要调控机制，主要包括磷酸化、泛素化、烷基化、S‑亚硝基化和ADP‑核糖基化等[5]。

NLRP3炎性小体主要由核心蛋白NLRP3、接头蛋白——凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis‑associated speck‑like protein, ASC）和效应蛋白——半胱天冬酶1（caspase‑1）在胞质内组装而成。核心蛋白NLRP3由3个可介导自身寡聚化和识别刺激的结构域组成，从氨基末端到碳末端依次为吡喃结构域（pyrin domain, PYD）、中心的核苷酸结合和寡聚化结构域（nucleotide binding and oligomerization domain, NACHT结构域）、富含亮氨酸重复结构域（leucine‑rich repeat domain, LRR结构域）。PYD和半胱天冬酶招募区（caspase recruitment domain, CARD）相连构成ASC。ASC可与NLRP3的PYD以及前体半胱天冬酶‑1（pro‑caspase‑1）的CARD相互募集，从而把NLRP3和pro‑caspase‑1联系在一起。caspase‑1则由pro‑caspase‑1自身裂解而激活，随后水解切割pro‑IL‑1β、IL‑18等促炎性细胞因子，分泌到胞外引发炎症反应。

目前公认用两步模型描绘巨噬细胞中经典的炎性小体激活。第一步称为“启动”。首先，Toll样受体或核苷酸结合寡聚化结构域NOD样受体接受刺激，NF‑κB入核启动转录并上调炎性小体复合物的各组分表达。第二步称为“激活”[6]，NLRP3在细菌、病毒、真菌感染后或在接触颗粒物、ATP、钾离子载体后活化，组装激活炎性小体复合物。上述两步需要严密调控，否则会引发不可控的炎症反应。

2.1　NLRP3炎性小体的磷酸化修饰

蛋白磷酸化在整个核苷酸结合寡聚化结构域NOD样受体家族的炎性小体调节以及伴随的信号转导通路中无处不在，在PTM中最为常见。

2.1.1　pyrin结构域的磷酸化

蛋白磷酸酶2A（protein phosphatase 2A, PP2A）与阿尔茨海默病及MYC基因驱动的多种癌症相关，能够催化PYD去磷酸化。

Stutz等[7]证明了PYD中人类的Ser5（或鼠的Ser3）残基磷酸化可抑制NLRP3炎性小体的激活。在未受刺激的状态下，Ser5残基磷酸化引入的负电荷通过静电排斥，干扰NLRP3和ASC二者PYD的彼此招募，从而防止炎性小体的意外组装。PP2A并不直接促进炎性小体的组装，而是使Ser5残基去磷酸化。这被称为NLRP3炎性小体的许可机制，是其装配前必需的步骤。

Luheshi等[8]发现PP2A抑制剂冈田酸可抑制NLRP3的激活。Stutz等[7]通过质谱分析进一步确认了PP2A抑制剂可导致脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）引发的巨噬细胞中Ser5残基磷酸化增加。同样，巨噬细胞中PP2A缺陷也造成了相似的结果。

近期，Mao等[9]发现布鲁顿酪氨酸激酶缺陷小鼠骨髓来源的巨噬细胞（bone marrow derived macrophages, BMDMs）中的NLRP3炎性小体激活增强。进一步的机制研究证明布鲁顿酪氨酸激酶以诱导PP2A Tyr307磷酸化的途径灭活PP2A，抑制PP2A介导的Ser5残基去磷酸化，进而抑制LPS/尼日利亚菌素的激活，但目前尚未鉴定出NLRP3的Ser5激酶。

2.1.2　LRR结构域的磷酸化

蛋白酪氨酸磷酸酶非受体型22（protein tyrosine phosphatase non‑receptor type 22, PTPN22）在先天性和适应性免疫细胞中特异表达并以多种方式调控免疫应答。

Spalinger等[10]证明在单核和巨噬细胞中，PTPN22可与NLRP3直接作用，并且在炎性小体激活后增强。活性刺激物依赖PTPN22干扰LRR结构域中人类的Tyr861残基的磷酸化，持续激活NLRP3炎性小体。用二氧化硅或单钠尿酸盐刺激小鼠，Ptpn22敲除小鼠的BMDMs和骨髓来源的树突状细胞（bone marrow‑derived dendritic cells, BMDCs）的炎症程度较轻。在葡聚糖硫酸钠盐诱导的小鼠急性肠道炎症模型中，PTPN22的缺乏加重了肠道炎症。在单钠尿酸盐诱导的小鼠腹膜炎模型中，与对照组相比，PTPN22敲除小鼠腹腔灌洗液中的IL‑1β水平更低[10]。说明PTPN22的去磷酸化作用可促进NLRP3炎性小体激活。Spalinger等[11]还发现NLRP3的Tyr861磷酸化介导了自噬小体对NLRP3的招募和降解，而PTPN22可同时影响NLRP3磷酸化和自噬。

2.1.3　NACHT结构域的磷酸化

2.1.3.1　蛋白激酶A（protein kinase A, PKA）

PKA是首个确定氨基酸序列的蛋白激酶，可磷酸化NACHT结构域。

Mortimer等[12]通过突变分析和使用靶向磷酸化PKA共有位点的抗体，证明PKA直接磷酸化NACHT结构域上人类的Ser295（或鼠的Ser291）残基。在炎性小体活化前后，用腺苷酸环化酶激活剂福司可林激活PKA信号通路均可抑制BMDMs和佛波酯诱导分化的人急性单核细胞白血病细胞中pro‑caspase‑1的切割和IL‑1β的成熟。与未磷酸化的对应物相比，体外应用PKA磷酸化重组GST‑NLRP3蛋白可以抑制NLRP3的酶促ATPase活性。

另两项研究也表明PKA可直接调节NLRP3炎性小体。前列腺素E2、胆汁酸均可抑制NLRP3炎性小体的活化[13‑14]，分别通过前列腺素E2受体亚型EP4和跨膜G耦联受体5激活腺苷酸环化酶，引起胞内环磷酸腺苷增加并触发PKA活化。但Ser295残基在静息时的磷酸化状态以及Ser295磷酸化调控NLRP3炎性小体的具体机制还需进一步探讨。

2.1.3.2　蛋白激酶D（protein kinase D, PKD）

不同于PKA磷酸化人类的Ser295（或鼠的Ser291）残基的抑制作用，NLRP3炎性小体必须经过PKD介导的Ser295磷酸化过程才能活化。

单钠尿酸盐、尼日利亚菌素促进NLRP3与线粒体相关内质网膜（mitchondria associated endoplasmic reticulum membranes, MAMs）的直接结合。Zhang等[15]发现MAMs与高尔基体邻近，用激活剂刺激后，二酰基甘油升高，且不受NLRP3缺失的影响。二酰基甘油在高尔基体的积累引发PKD的激活，活化的PKD与NLRP3相互作用，可使NLRP3中的Ser293残基磷酸化。NLRP3从MAMs上脱离，释入细胞质，继而组装为成熟的炎性小体复合物。高尔基体完整性的破坏以及PKD的缺乏可减轻炎症，抑制PKD能使NLRP3滞留在邻近高尔基体的MAMs上，还可减弱Cryopyrin蛋白相关周期性综合征患者外周血单核细胞中的炎症信号。

矛盾的是，PKA和PKD磷酸化同一位点却导致了相反的结果。鉴于Gao等[16]在pyrin炎性小体激活机制中曾提出炎性小体的激活需要连续的磷酸化和去磷酸化过程，Ser295残基磷酸化可能具有双向功能，涉及两种不同激酶在同一位点的反向作用。

2.1.3.3　c‑Jun氨基末端激酶

Song等[17]筛出NLRP3上从氨基端PYD到碳端LRR中的磷酸化残基，用不可磷酸化的丙氨酸依次代替这些磷酸化位点来检查其功能，发现鼠的Ser194（或人类的Ser198）残基突变后，激活NLRP3明显受阻。他们又利用生物信息学工具分析了磷酸化位点，筛选出几种可能的磷酸化Ser194残基的激酶，再抑制这些激酶来观察影响，进而确定了c‑Jun氨基末端激酶（c‑Jun N‑terminal kinase, JNK）1可通过促进NLRP3的自缔合和去泛素化直接磷酸化NLRP3的Ser194残基。JNK1缺乏和JNK1抑制剂分别阻断了BMDMs、人类原代单核细胞中NLRP3炎性小体激活，NLRP3‑S194A突变体在体外和体内均无法激活NLRP3。

Song等[17]还指出，Ser194残基的磷酸化发生在启动过程，因为在LPS刺激BMDMs后即可观察到该磷酸化，但在未经启动的情况下，单钠尿酸盐和尼日利亚菌素不能诱导该磷酸化[17]。

值得一提的是，Ser194的磷酸化水平较低，说明JNK1只作用于一小部分NLRP3。磷酸化的NLRP3很可能充当“种子”诱导非磷酸化的NLRP3发生构象变化，促进炎性小体复合物的形成。

2.1.4　CARD结构域的磷酸化

巨噬细胞中NLRP3炎性小体组装的先决条件还包括ASC磷酸化，脾脏酪氨酸激酶和JNK激酶能磷酸化小鼠ASC上CARD结构域的Tyr144与人类ASC中的Tyr146和Tyr187[18‑19]。Hara等[18]证明抑制脾脏酪氨酸激酶或JNK能够消除小鼠腹腔巨噬细胞中ASC斑点的形成，且不影响ASC与NLRP3的相互作用。这表明ASC磷酸化可能影响二者相互作用的下游事件，例如通过CARD‑CARD相互作用迁移到核周区域、自缔合或募集前体半胱天冬酶‑1的能力。通过突变磷酸化位点，Hara等[18]将ASC的Tyr144鉴定为ASC斑点形成的关键位点。与上述巨噬细胞中的研究相反，ASC磷酸化对于BMDCs中的炎性激活似乎不重要。Gross等[20]报道称，脾酪氨酸激酶对于ATP或尼日利亚菌素诱导的BMDCs炎性激活不是必需的。这种细胞类型所致差异的原因有待探究。

2.2　NLRP3炎性小体的泛素化修饰

相比其他翻译后修饰，泛素化更为复杂。其修饰包括在同一残基的单泛素化修饰、不同残基的多个单泛素化或同一残基重复发生的多聚泛素化。常见的NLRP3泛素化残基位点有K48、K63。E1泛素激活酶、E2泛素结合酶和E3泛素连接酶在泛素化NLRP3过程中先后发挥作用，而此过程又可被去泛素酶逆转。泛素化在调节NLRP3炎性小体激活时兼有负向与正向作用，具体取决于修饰类型和连接酶种类。

多种E3泛素链接酶可以负调控NLRP3。Skp1‑Cullin1‑F‑box E3连接酶复合物的亚基F‑box L2可促进静息状态下NLRP3的泛素化修饰和降解[21]。多巴胺D1受体激活后，膜相关环指蛋白7可多聚泛素化LRR结构域上K48位点以及促NLRP3的自噬降解[22]。此外，Ariadne同源物2可通过泛素化NACHT结构域抑制NLRP3[23]。两种E3泛素连接酶RNF125和Cbl‑b依次泛素化NLRP3抑制其活化和小鼠脓毒症的发生、发展[2]。相比之下，目前能下调NLRP3炎性小体的去泛素酶仅有A20[24]。

E3泛素连接酶也可作为正向调控分子。LPS刺激后，另一种Skp1‑Cullin1‑F‑box E3连接酶复合物的亚基F‑boxO3表达增加，通过降解F‑box L2促进炎症反应的发生[21]。Pellino2蛋白在启动阶段可泛素化NLRP3 K63位点[25]。

去泛素酶也有助于NLRP3炎性小体的激活。泛素特异性蛋白酶7和泛素特异性蛋白酶47可通过促进ASC寡聚和斑点形成进行正调控[26]。此外，BRCC36同肽酶复合体的两种成分BRCC3和ABRO1也可通过去泛素化协同激活NLRP3[27]。

2.3　其他PTM

其他PTM还包括烷基化、S‑亚硝基化、ADP‑核糖基化等。Juliana等[28]首先报道了NLRP3的烷基化反应并发现一些NLRP3特异性抑制剂可以直接烷基化NLRP3。NLRP3烷基化通过损害NLRP3的ATPase活性，影响NLRP3的自缔合及其与ASC的结合。已证明一氧化氮可通过S‑亚硝基化半胱氨酸残基下调NLRP3以及IL‑1β、IL‑18从活化巨噬细胞中释放。在结核分枝杆菌感染的巨噬细胞中，无论是用干扰素‑γ诱导一氧化氮或是直接添加一氧化氮供体均能有效抑制IL‑1β的释放[29]。肺炎支原体社区获得性呼吸窘迫综合征毒素能够与NLRP3共定位并直接催化其ADP‑核糖基化[30]。

脓毒症的病理生理过程极其复杂，包括过度炎症、免疫抑制和免疫稳态缺失。近年来人们对该过程有了较深入的认识，但仍无有效的临床治疗方法。感染后，免疫系统首当其冲，而NLRP3/半胱天冬酶‑1/IL‑1轴则是先天免疫系统和炎症发生、发展的关键信号通路。

腹腔注射LPS和盲肠结扎穿孔是两种经典的小鼠脓毒症模型。LPS激活Toll样受体是经典NLRP3两步激活模型中的启动信号[6]。而在盲肠结扎穿孔模型中，NLRP3缺乏可减轻小鼠炎症反应并提高其存活率[31]。因而NLRP3有希望成为脓毒症治疗的分子靶标。研究表明，NLRP3可以激活CD4+T细胞介导的Th1细胞免疫应答[32]。此外，NLRP3还可维持正常的肠道菌群，避免肠道菌群移位所致的脓毒症。IL‑1β和IL‑18是先天免疫系统识别不同病原体后最早释放的促炎细胞因子，可分别激活淋巴细胞和极化Th1细胞[33]。NLRP3下游的半胱天冬酶‑1也可激活成孔蛋白gasdermin D，进一步介导焦亡，引发巨噬细胞或树突状细胞的死亡[34]。这些免疫细胞的死亡可导致脓毒症后期免疫抑制的发生、发展。

NLRP3炎性小体及其下游炎症因子（IL‑1β和IL‑18等）在炎症信号通路中发挥了重要作用。PTM对NLRP3的激活或抑制必不可少。既往针对NLRP3的PTM调控研究高度依赖于体外系统，且较少着眼于脓毒症的研究，将来应关注在体研究并探讨其在脓毒症发生、发展中的作用及其可能治疗的靶点。