导读
生物多样性的丧失被认为是对生态系统功能有害的，但是缺乏对土壤中这一过程的机械理解和理论支持。我们以前的研究发现，在淹水水稻土中，有机氯污染物的还原脱氯通常伴随着甲烷生成。这里，以一种典型的有机氯农药六氯环己烷异构体林丹（γ-HCH）为例，我们通过用一种连续稀释的土壤悬浮液接种辐照过的无菌土壤，人为操纵土壤微生物群，以解决微生物多样性丧失对γ-HCH降解和甲烷生成的影响。γ-HCH的存在推迟了所有处理中的甲烷的生成，但是随着稀释水平的增加，甲烷生成表现出增加的性能。稀释对γ-HCH降解率几乎没有负面影响。稀释增强了γ-HCH降解和甲烷生成之间的耦合，共现网络和RDA分析证明了这一点。相对功能冗余指数（rFRI）、群落组装、群落结构和功能多样性均受到稀释的显著影响，细菌群落比古细菌群落差异更大。零模型分析表明，随机过程的相对贡献在细菌群落重组中随着稀释而增加，但在古细菌中减少。甲烷生成和脱氯之间的强耦合与特定的微生物类群有关。土壤微生物多样性的丧失会对特定的土壤功能（如污染修复和温室气体排放）产生重要影响，功能恢复受共生微生物和装配过程的竞争和协同介导机制的调节。
原名：Loss of microbial diversity does not decreaseγ-HCH degradation but increases methanogenesis in flooded paddy soil
译名：微生物多样性的丧失不会减少γ-HCH降解，但会增加淹水水稻土中甲烷的生成
期刊：Soil Biology and Biochemistry
IF：5.795
发表时间：2021.03.09
通讯作者：何艳
通讯作者单位：浙江大学环境与资源学院
在第30天，未稀释（6.3 mg kg−1）、10-2稀释（5.7 mg kg−1）和10-4稀释（5.2 mg kg−1）之间的γ-HCH残留浓度没有观察到显著差异，但10-8稀释（3.8 mg kg−1）和其他三种处理之间出现了显著差异（P < 0.05）（图1A）。与未稀释的对照组（CK）相比，γ-HCH降解的降低速率不受稀释的影响（图1A）。到孵育第5天，50 mg kg−1浓度的γ-HCH残留物的γ-HCH初始浓度下降57.4%-63.5%，下降顺序为未稀释（21.3 mg kg−1）> 10-2稀释（20.9 mg kg−1）> 10-8稀释（19.6 mg kg−1）> 10-4稀释（18.3 mg kg−1）。从第15天开始，土壤中剩余的γ-HCH残留物在未稀释处理中最高，γ-HCH的降解在稀释处理中增加。累积CH4产量在所有处理中都是超时测量的。与CK处理相比，稀释处理强烈促进CH4生成，γ-HCH的加入在一定程度上延缓了CH4生成过程。在含和不含γ-HCH的CK处理中孵育30天后，CH4累积产量分别为11.5 μmol和19.4 μmol，而含和不含γ-HCH的稀释处理分别为30.1-38.5 μmol和34.3-44.1 μmol（图1B）。
图1.土壤中γ-HCH降解和甲烷生成的动态变化。（A）γ-HCH剩余浓度（B）CH4累积浓度。CK：未消毒土壤的缩影；D2、D4和D8：分别用10-2、10-4和10-8稀释度的微生物悬液接种的无菌土壤微宇宙。误差棒为三次重复平均值的标准误差。正如预期的那样，稀释组之间细菌群落多样性的降低（图
2A1）得到了各种多样性指标的支持（表S2）。然而，在所有处理中，添加γ-HCH对若干α-多样性指数没有显著影响（P < 0.05）（表S2）。未稀释土壤的平均香农指数较高（6.28±0.09，a），其次是D2稀释度（5.02±0.10，b），D4稀释度（4.95±0.13，b）和D8稀释度（4.50±0.30，c），与基尼-辛普森、皮埃罗均匀度和费希尔指数呈相同趋势。令人惊讶的是，对于古细菌群落，来自稀释组的样品具有更高的α-多样性，特别是在D2稀释处理中，其香农指数最高，并且与CK处理具有显著差异（P < 0.05）（图2A2）。随着连续稀释，细菌和古细菌群落的OTU数不成比例地减少（图S4A和4B）。通过基于布雷-柯蒂斯距离的主坐标分析来分析微生物群落结构的差异（图2B）。D2和D4处理在PCo1轴上的投影相对接近，与CK和D8分开，表明逐步稀释诱导了细菌群落结构的分化（图2B1）。此外，稀释处理显著改变了优势种和稀有种在属水平上的平均比例，如Geobacter、WHCB1-32、Fonticella和Clostridium_sensu_stricto_10（P < 0.05）（图S2A；图S3）。与细菌群落不同，不同处理中古细菌群落结构分化的距离相对较小（图2B2）。与未稀释的处理相比，D2、D4和D8处理中的Methanomassiliicoccus和Methanobacterium显著增加，而Candidatus_Nitrocosmicus的相对丰度显著降低（图S2B）。
图2.不同稀释梯度下细菌和古细菌的香农指数变化（A1，A2）和PCoA分析（B1，B2）。不同的字母表示不同处理之间在P < 0.05水平上的显著差异。“L”表示添加γ-HCH处理，“N”表示对照处理。
图S3 连续稀释处理（图顺序为D2、D4和D8）与未稀释处理（CK）细菌群落属水平变异分析。蓝色条和点表示未稀释处理，橙色条和点表示D2（10-2稀释）处理，绿色条和点表示D4（10-4稀释）处理，紫色条和点表示D8（10-8稀释）处理。
构建共现网络分析来探索细菌间的相互关系（图
3）。总体而言，CK、D2、D4和D8网络由450、129、128、117个节点组成，总边数分别为2127、343、341和260。与具有最高连接度（连接度22）的节点相对应的物种是CK网络中的Dehalococcoidia_bacterium_SCGC_AB-540-C11（Chloroflexi门）。在稀释网络中，重点种有Geobacter（Proteobacteria门），Sedimentibacter和Clostridium_sensu_stricto_1。根据以前的研究，大多数还原脱氯剂主要存在于Chloroflexi，Proteobacteria 和 Firmicutes三个门（Adrian andLoffler，2016）。有趣的是，在共生网络中，这三个门的核心类群的总数分别占核心微生物总数的57.5% （CK）、92.7%（D2）、60.2% （D4）和70.0% （D8）。识别强相关土壤的生态群从细菌群落，包括独特的土壤功能组，物种聚类和基于整个OTU表数据的模块划分进行。在图4A，青绿色模块包含248个属级物种，明显大于其他模块（图4A）。通过“Tax4Fun2”包对细菌和古细菌群落的主要模块（青绿色模块）的基因功能的预测，通过提取丰度和功能数据并将它们分组可视化，更详细地揭示了功能基因的变化特征（图4B）。我们发现，功能基因的相对丰度并没有随着稀释梯度成比例地降低，甚至一些功能基因的相对丰度也显著增加。例如，与CH4代谢相关的古细菌中的功能基因代谢途径在稀释组中显著增加（P < 0.05）（图4B）。进一步分析了54个稀释处理和18个参考样品中细菌和古细菌的功能冗余指数。来自细菌和古细菌的大约8309和3192个功能在CK参考样品中显示出更高的功能冗余，而在稀释组中只有87和470个功能具有更高的冗余。在稀释组中，大多数功能的rFRI大大降低（图4C和D）。
图3. 细菌群落共现网络分析。彩色节点表示关键种（连接度≥ 10），不同颜色代表每个种（属）在门水平上的分类。百分比值是指每一门级包含的物种数占总网络的比例。灰点表示外围节点（连接度< 10）。字母n代表节点总数，e代表边数。节点的大小表示连接的程度。（关于此图图例中颜色参考的解释，读者可参考本文的网络版）。
图4. 微生物聚类和基因功能预测。A. 基于拓扑重叠矩阵计算聚类距离，采用动态树切割的方法进行模块划分。不同的颜色代表不同的模块（除了灰色表示没有聚类）。每个模块对应的物种数：黑色，12；蓝色，37；棕色，29；绿色，23；灰色，11；红色，12；青绿色，248；黄色，25。B. 基于功能预测的16S rRNA基因序列（对应于细菌群落的OTU序列在图4a的青绿色模块中选择。对于相同的功能基因，不同的字母表示处理之间的显著差异（p <0.05）。CK和稀释土壤的相对功能冗余指数（rFRI）。所有的预测都是使用97%的相似性截止值来实现的。大于0的对数比率表明在CK组中更冗余。当对数比等于正或负无穷大时(KO值只存在于CK组或稀释组)，该值统一设置为10或-10。（关于此图图例中颜色参考的解释，读者可参考本文的网络版）。相对丰度反映了微生物比例的变化，但不能提供微生物数量的绝对量化。微生物组的定量，结合相对丰度，可以更好地反映土壤中微生物群落的真实变化。微生物数量的定量分析表明，微生物的数量并没有随着稀释的逐步进行而成比例地减少。随着培养时间的增加，不同稀释梯度下的微生物总量趋于均匀（图5E和F）。与细菌群落相比，古菌微生物组的定量分析低一个数量级。第20天，在不添加γ-HCH的处理中，古细菌的拷贝数较高（图5F）。Dhc、Dsr、Geo和mcrA的基因拷贝数分别用作脱氯剂、硫酸盐还原菌、铁还原菌和产甲烷菌丰度的替代物（图5A、B、5C和5D）。在所有微宇宙中，γ-HCH的加入增加了第20天Geo、Dsr和Dhc基因的基因拷贝数（图5A、B、5C)。γ-HCH攻击组的mcrA基因拷贝数低于对照组（第20天）。然而，在有或没有γ-HCH的处理组中，稀释显著增加了mcrA基因的基因拷贝数（图5D），并且在稀释的处理中mcrA/细菌和mcrA/古细菌的比率也增加了（图S4C和4D）。总的来说，稀释处理对微宇宙中产甲烷菌的丰度有显著的促进作用。为了专门研究负责脱氯和产甲烷的微生物之间的相互作用，我们直接选择了具有脱氯或产甲烷功能的微生物（在属水平上），这些功能是基于以前的文献报道的。对于功能冗余分析，甲烷生成过程和γ-HCH降解在本研究中呈正相关（图6A）。Methanomassiliicoccus、Methanosarcina和Clostridium_sensu_stricto_10与甲烷积累和γ-HCH降解呈正相关。同样，对于共现网络关系，我们发现产甲烷菌如Methanomassiliicoccus，Methanosarcina和Rice_cluster_1，也与脱氯菌属（如Clostridium_sensu_stricto_10，Desulfitobacterium）呈正相关（图6B）。出乎意料的是，在稀释处理中，脱氯和产甲烷微生物之间的潜在相互作用增强，节点和边缘的数量都显著增加（表1）。
图5. 在接种了不同稀释度的土壤的微宇宙中，通过逆转录-定量聚合酶链反应对微生物组和四种功能基因进行定量分析，无（灰色条）和（蓝色条）有γ-HCH修正。误差棒为三次重复平均值的标准误差。（A）Geo，（B）Dsr，（C）Dhc，（D）mcrA，（E）细菌，（F）古细菌。对于每个图，横坐标表示每个基因在不同时间点的拷贝数。在第5天（5CK、5D2、5D4、5D8）、第20天（20CK、20D2、20D4、20D8）和第30天（30CK、30D2、30D4、30D8）进行定量。
图S4 土壤中细菌(A)和古细菌(B) OTUs数量的变化mcrA基因拷贝数与细菌的比值(C)，与古菌的比值(D)。
图6. 细菌和古细菌群落中微生物（脱氯和产甲烷菌属）的冗余分析和共现网络分析。a. 不同系列稀释处理中微生物和环境变量的冗余分析。b. 脱氯与产甲烷菌属显著相关的交互作用网络分析（P < 0.05，|R| > 0.5）。红色边缘表示正相关，蓝色边缘表示负相关。表1 不同处理中脱氯微生物与产甲烷菌的相互作用网络信息
零模型分析揭示了群落中确定性和随机组合过程的相对影响。细菌群落的最大平均βNTI出现在未稀释的对照中。随着稀释水平的增加，群落组合从确定性过程（|βNTI| > 2）转变为随机过程（|βNTI| < 2）。随着稀释度的增加，未污染和均质化扩散（随机过程）的相对影响增加（图7A1和B1）。然而，古细菌群落的βNTI分布因细菌而异，随机组合过程在所有处理中占主导地位，并且随着稀释度的增加，趋向于向确定性过程（|βNTI > 2）移动，这也反映在异质性选择的相对重要性的增加上（图7A2和7B2）。
图7. 基于零模型分析的微生物群落组和过程。A. βNTI值与细菌（A1）和古细菌群落（A2）中的稀释度相关。微生物群落组装中的生态过程主要由随机过程（均质化扩散和扩散限制）和确定性过程（异质性和可变选择）控制，而在水稻土中不受任何单一过程控制的部分（“未终止”）。细菌和古细菌多样性之间关系的概念方案，其功能响应梯度稀释。对于细菌群落，我们使用不同的颜色来概念化不同的物种。蓝色代表土壤环境中具有一般功能的丰富物种，橙色和红色代表参与还原脱氯的专性和兼性物种。其他生物代表共生生态网络中的所有其他物种。在古细菌群落中，灰色的代表所有的产甲烷菌，其他颜色代表水稻土中共存的古细菌微生物。图的中间部分表示微生物群落的组装过程。从亮到暗的灰色显示了确定性增加的过程。两侧的上下饼图分别代表对照组和γ-HCH加法组的随机和确定性过程的相对贡献。左边的散点图显示了射频识别的相对强度。红点表示CK组的功能比稀释组更冗余，相反，绿点表示稀释组的功能更冗余。1 微生物多样性丧失对γ-HCH降解和甲烷生成的影响先前的研究探索了微生物多样性和土壤特定功能之间的关系，如碳和氮循环，植物生长和污染物降解。有研究者指出，微生物多样性丧失在中间水平的不良影响可以通过其他功能相似的微生物群的互补生长，通过功能冗余得到补偿。然而，另一项研究表明，土壤中微生物多样性的任何减少都会强烈影响杀菌剂百菌清的矿化。在我们目前的研究中，γ-HCH在土壤中的降解过程并没有随着稀释度的增加而减少，这表明功能冗余可能维持了γ-HCH在土壤中的降解，这与以前的研究一直。据报道，土壤生物多样性的减少也增加了其他土壤功能。我们的结果表明稀释处理促进了甲烷生成，表明具有高多样性的复杂微生物群落可能对甲烷生成过程有不利影响。这导致了土壤微生物多样性下降对全球温室气体排放的潜在风险（图1B）。稀释处理对古细菌群落差异的影响小于细菌（α多样性和β多样性）。可能的原因很可能是因为两个方面。首先，在极端条件下，古菌比细菌更有能力恢复或复活（在我们的例子中，γ-HCH的物种多样性丧失和污染胁迫）。其次，由于与古细菌相比，细菌群落具有更高的多样性和复杂性，通过逐步稀释显著减少细菌群落提供了更有利的生态位（例如资源、空间等）并减少了对古细菌群落的竞争。连续稀释显著改变了参与有机氯农药降解和甲烷生成的功能微生物群落的组成和结构。据报道，对有机氯化合物具有还原脱氯活性的微生物主要包括Desulfitobacterium、Geobacter、Sedimentibacter、Clostridium、Acinetobacter、Pseudomonas和Flavobacterium。一些专性厌氧菌只限于有机卤化物呼吸产生能量和生长，如Dehalococcoides和Dehalobacter也有报道。在本研究中，Desulfitobacterium, Clostridium和Sedimentibacter的相对丰度显著增加，而专性脱氯细菌Dehalobacterium和 Dehalococcoidia_bacterium_SCGC_AB-540-C11的相对丰度在所有处理中都保持在较低水平，比兼性细菌低3个数量级。先前的研究表明，土壤中的稀有物种可能在增强地上和地下植物的防御方面发挥作用。有研究者发现，无论是Sendimentibacter还是Dehalobacter都不能单独降解OCPs，但在共培养体系中起着重要作用。这表明兼性脱氯剂和强制脱氯剂的协同调节机制更可能参与γ-HCH耗散，而不是典型的脱氯剂。稀释还可以减少稀有物种的环境抑制因素（如生态位限制、种间竞争等）（不仅是专性脱氯器，还是兼性脱氯器），从而为降解提供更有利的环境条件，以提高脱氯率，共现网络中脱氯器的更高连通度证明了这一点（图3）。因此，在稀释组中可以保持较高的脱氯率，这更可能是脱氯剂通过功能冗余的强化活性和互补增长。为了进一步量化功能冗余的强度，基于具有特定功能的物种的比例及其系统发育关系来计算rFRI（Wemheuer等人，2018）。稀释组中rFRI的减少表明功能基因存在于更少的物种中，具有更紧密的系统发育关系。考虑到来自连续稀释的特定功能（例如甲烷代谢、异生物质降解和碳代谢）的相对丰度没有降低甚至更高，可以推测，可能通过更少微生物的生长和繁殖来维持和提高关键土壤过程的速率。这也与专门功能微生物相对丰度的显著增加相一致，包括Desulfitobacterium，Clostridium，Sedimentibacter 和产甲烷古菌 Methanomassiliicoccus 和 Methanobacterium （图S2和S3）。这更深入地解释了为什么在稀释处理期间脱氯和甲烷生成过程得以维持甚至促进。然而，尽管微生物多样性的丧失对特定的土壤功能没有不良影响，但稀释后重组微生物群落的功能冗余被严重削弱（图4C和D）。基于这一研究，添加持续的外部干扰可能会导致微观世界内的功能崩溃。我们以前的研究也发现还原脱氯通常伴随着甲烷生成。令人惊讶的是，在水稻土中，五氯苯酚的降解和甲烷生成过程同时受到BES （2-溴乙磺酸盐，一种典型的甲烷生成抑制剂）的抑制或受到CoM（辅酶M，一种促进甲烷生成的辅因子）的刺激，这表明甲烷生成可能会增强脱氯作用。研究还表明，产甲烷菌在有机氯农药的还原脱氯中起着积极的作用。我们观察到产甲烷菌和脱氯菌之间呈正相关（图6）。稀释组的网络相互作用增强（表1）。这意味着随着多样性的降低，γ-HCH脱氯作用和甲烷生成作用关系增强。虽然我们发现γ-HCH胁迫并不总是导致细菌和古细菌群落的α-多样性下降（表S2），但在气候变暖等其他因素的驱动下，农田土壤中的微生物多样性正在丧失，如农业管理、重金属胁迫和化肥投入。这对遭受微生物多样性损失的淹水土壤中增加温室气体排放的潜在风险具有重要意义。然而，在含有OCPs残留物的淹水水稻土中，由于多样性丧失导致的甲烷生成增加也促进了脱氯，从而加速了残留有机氯农药的去除。零模型分析结果表明，不同的生态过程分别控制着细菌和古细菌群落的重组。随着稀释梯度的增加，细菌群落的组合过程从确定性向随机性转变（图7A1，B1，C），而古细菌群落的确定性增加（图7A2，B2，C）。一个可能的原因可能是由于细菌的群落多样性随着稀释度的增加而减少。因此，将释放更多的资源和生态位，从而减少对细菌生长的环境限制。在种间竞争减少的情况下，随机性的增加将有利于稀有物种，如部分脱氯剂更强烈地适应变化的环境（随机扩散），因为它们对栖息地特异性的典型限制。因此，还原脱氯的速率可以保持，如建议的概念性方案所示（图7C）。然而，对于古细菌群落的重组，即使随机过程占主导地位，决定论的相对贡献随着稀释水平的提高而增加（图7A2，B2和C）。正如Fierer （2017）所建议的，驱动组合过程的决定论因素包括生物和非生物影响。在本研究中，受多样性损失增加和γ-HCH相关压力的影响，淹水土壤条件下的一些产甲烷菌（例如，特别是那些能够与脱氯作用结合的产甲烷菌）可能比其他古细菌群落具有竞争优势。因此，甲烷生成过程通过稀释得到促进，如所提出的概念方案所示（图7C）。尽管在稀释组中显示甲烷生成和脱氯之间的耦合增强，但是微生物群落（古细菌和细菌）的FRI的急剧下降表明特定的功能基因（例如甲烷代谢、异生物质降解）仅存在于具有更紧密系统发育关系的少数物种中（图4C、D和图7C）。换句话说，重新组合的微生物群落的功能冗余强度远低于CK群，这表明增加持续压力（在我们的情况下，γ-HCH压力）可能导致微观世界的功能崩溃。我们的研究提供了实验证据，表明微生物多样性的丧失会影响与γ-HCH还原降解和甲烷生成相关的关键土壤过程。研究表明，微生物多样性的丧失对微生物介导的γ-HCH降解影响不大，但会增加温室气体CH4的排放。因此，功能冗余的作用不容忽视。稀释在组合过程中对细菌群落、群落多样性和功能多样性的影响比古细菌更显著。我们还提供了γ-HCH还原脱氯与甲烷生成之间正相关的证据，同时，这两个过程之间的耦合随着稀释而增强，表明在多样性丧失的情况下，强化的甲烷生成过程将加速剩余γ-HCH的去除。零模型分析表明，随机和确定性过程在微生物群落的恢复中发挥了作用。越来越多的随机组装导致细菌群落中稀有物种脱氯剂的竞争越来越激烈。类似地，确定性过程的增加在稀释组中形成了更多样的古细菌群落，CH4释放速率更快。总之，我们的研究表明，土壤微生物多样性的丧失与生物（在我们的情况下，多样性丧失引起的种间相互作用的变化）和非生物（在我们的情况下，γ-HCH应力）环境因素的变化相关，可能对陆地生态系统中的特殊土壤功能（在我们的情况下，污染自我净化和温室气体排放）产生重要影响。这为通过连续稀释或增加环境胁迫改变土壤微生物多样性，使群落聚集在可控水平，从而调控土壤微生态功能提供了更好的证据。这种现象在不同土壤类型中的存在以及微生物多样性的丧失对其他土壤功能的影响值得进一步研究。
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