基因药物系列（四）——基因编辑（下）

作者：药链圈

基因编辑（上）篇我们介绍了基因编辑的发展历史和三代基因编辑技术的优劣势对比。下篇我们将重点介绍基因编辑的主要企业和产品研发进度，以及基因编辑技术的应用亮点和未来发展趋势。

基因编辑主要企业和产品研发进度

Sangamo

Sangamo位于美国，已经深耕ZFNs基因编辑技术有20余年，并且是该技术的主要专利持有者。由于Sangamo的研究和开发工作，ZFNs在基因编辑领域取得了多项第一：第一个编辑人类细胞基因、第一个编辑体外基因和第一个编辑体内基因。通过技术改进，Sangamo将ZFNs的开发周期由三个月缩短至10天，缩小了这项技术在开发周期上与CRISPR/Cas技术的差距。

公司同时基于ZFNs技术开发了四大药物平台——基因治疗、细胞治疗、体内基因组编辑和体内基因组调节。并与辉瑞、赛诺菲等制药巨头建立了合作关系，目前在研的药物共有21，各覆盖遗传病、肿瘤、神经系统疾病等领域。

图：Sangamo的四大药物平台研发管线

资料来源：根据公开资料整理

Editas Medicine

由CRISPR/Cas基因编辑三巨头之一——张锋博士创建, 致力于将CRISPR/Cas9和CRISPR/Cas12a基因组编辑系统的能力和潜力转化为治疗世界各地严重疾病患者的药物。Editas公司的研究和开发工作主要集中在那些治疗手段很少或尚无治疗手段的疾病上，目前拥有9个在研项目，适应症涵盖眼部疾病、杜氏肌肉营养不良症、神经系统疾病、镰状细胞病、β地中海贫血、癌症等，此外公司也正在与合作伙伴开发基于CRISPR/Cas系统编辑免疫细胞治疗。

Editas目前已与多家公司建立了合作关系，包括艾尔建、AskBio、BlueRock和百时美施贵宝等，其中与艾尔建合作开发的EDIT-101是Editas公司在研产品线中进展最快的产品，也是世界上首个进入临床试验的CRISPR基因编辑药物。

Leber先天性黑蒙10型（LCA10）是一种常染色体隐性遗传病，由CEP290基因中的双等位基因功能丧失突变引起。通常出现在婴儿早期，患者表现出严重的视锥营养不良，而且视力低下，甚至完全丧失。2017年12月10日，FDA批准了Spark公司的AAV基因疗法，通过腺相关病毒AAV，将正确的RPE65基因递送到视网膜细胞，从而治疗Leber先天性黑蒙2型，该疗法是FDA批准的首个基因疗法，售价高达85万美元/年。

然而，这一方法却对Leber先天性黑蒙10型（LCA10）无能为力，因为CEP290基因的编码序列长达7.5kb，远超AAV病毒的包装能力极限（4.7kb），因此无法通过AAV递送正确编码的CEP290基因的方式来治疗。

Editas Medicine的研究团队通过使用AAV5载体通过视网膜下注射，将saCas9和CEP290特异性gRNA递送至感光细胞，通过双gRNA分别靶向突变内含子区域的上下游，直接将突变内含子区域整体删除或倒位，从而恢复CEP290基因的正常表达，进而让眼睛重获光明。这一方法，巧妙的避免了AAV病毒包装能力的局限，也为这一类遗传病的治疗带来了全新的研究思路。

图：Editas Medicine的药物研发管线

资料来源：根据公开资料整理

CRISPR Therapeutics

CRISPR Therapeutics由诺贝尔奖获得者，CRISPR作用原理的发现人之一Emmanulle Charpentier创建，专注于利用其专有的CRISPR/Cas9平台开发治疗严重疾病的变革性基因药物。CRISPR Therapeutics公司已经建立了一系列的产品管线，涵盖血红蛋白病、肿瘤学、再生医学和罕见病四大领域。该公司在血红蛋白病领域的产品CTX001和在免疫肿瘤学领域有3个在研产品CTX110、CTX120、CTX130，均已进入到临床试验阶段；在再生医学领域，有一款针对I型糖尿病的产品正在申请临床试验。此外，该公司还有四个针对糖原贮积病Ia型（GSD Ia）、杜氏肌营养不良(DMD)、强直性肌营养不良1型(DM1)、囊性纤维化（CF）的研究项目，正处于临床前研究阶段。

目前，CRISPR Therapeutics已与拜耳，Vertex Pharmaceuticals和ViaCyte 等公司建立了战略合作关系。2019年11月，CRISPR Therapeutics和Vertex Pharmaceuticals联合宣布，CRISPR/Cas9基因编辑疗法CTX001在正在进行的1/2期临床试验中取得积极中期数据：一名输血依赖性β地中海贫血症（TDT）患者和一名严重镰状细胞贫血症（SCD）患者在接受CTX001治疗后，均达到停止依赖输血的效果。基于CRISPR/Cas9基因编辑的3个免疫细胞也都进入临床试验阶段。

图：CRISPR Therapeutics的药物研发管线

资料来源：根据公开资料整理

Intellia Therapeutics

Intellia公司由诺贝尔奖获得者，CRISPR作用原理的发现人之一Jennifer Doudna联合创建，公司利用CRISPR/Cas9技术开发创新疗法，以治疗严重和危及生命的遗传病、肿瘤和免疫疾病。依托其自身的基因编辑的体外和体内治疗平台，Intellia公司已经建立了涵盖多种疾病的在研产品管线。

公司的体内治疗产品线包括5个项目，针对转甲状腺素蛋白淀粉样变性(ATTR）多发性神经病和心肌病、遗传性血管性水肿(HAE) 等适应症等。其中，治疗转甲状腺素淀粉样变性多发性神经病和心肌病的在研产品NTLA-2001，由Intellia与Regeneron共同开发，是公司第一个进入临床的CRISPR/Cas9疗法。

在体外治疗方面，Intellia正在利用CRISPR对细胞进行工程改造，以开发出针对血液癌症和实体瘤的疗法。目前体外治疗产品线包含多个项目，涉及镰状细胞病、急性髓细胞白血病（AML）、实体瘤等适应症。此外，Intellia也在与诺华生物医学研究所合作，开发CAR-T、和造血干细胞(HSCs)等疗法。其基于CRISPR / Cas9基因编辑的造血干细胞（HSC）疗法目前也已经进入临床试验。

图：Intellia Therapeutics的药物研发管线

资料来源：根据公开资料整理

基因编辑技术的应用亮点

治疗遗传病的技术和成本优势

治疗遗传病的药物有很多种类，其中最为重要的一种就是基于AAV载体的遗传病治疗药物，但是这类药物有两个缺点，一是售价高，二是AAV载体包装能力有限，如前文所述， Spark公司的AAV基因疗法，通过腺相关病毒AAV，将正确的RPE65基因递送到视网膜细胞，从而治疗Leber先天性黑蒙2型，该疗法是FDA批准的首个基因疗法，售价高达85万美元/年。然而，这一方法却对Leber先天性黑蒙10型（LCA10）无能为力，因为CEP290基因的编码序列长达7.5kb，远超AAV病毒的包装能力极限（4.7kb）。而基因编辑药物可以编辑更长的基因序列，成本也要低得多。

提高CAR-T细胞的制备效率和功能

CAR-T细胞疗法通过采集患者身体内的T细胞，然后经过携带CAR基因的病毒改造后回输到人的体内，达到治疗癌症的目的，原始的制备方法用时长、难度高、成本大，还有可能会引起人的自身免疫反应。基因编辑可以显著提高CAR-T细胞的制备能力和效率。我国科学家王皓毅研究组2016年利用CRIPSR/Cas9技术对CAR-T细胞进行了TRAC、B2M双基因敲除和TRAC、B2M和PD-1的三基因敲除，大大降低了自身免疫原性显著提高了CAR-T抗肿瘤活性；2017年国外课题组同样利用CRISPR/Cas9技术敲除TCR和HLA-I相关基因，敲除后的CAR-T未观察到GVHD；此外，在临床上也有报道接受UCAR-T治疗成功的案例。

为治愈HIV带来曙光

2019年，美国坦普尔大学和内布拉斯加大学医学中心的研究团队称，他们能够使用CRISPR/Cas技术在人源化小鼠身上摧毁HIV，这是人类首次证明HIV是可以被治愈的。

同年，中国科学家对人类干细胞进行体外基因编辑，使其天然能够抵御HIV，并将其移植到一名罹患血液系统肿瘤的HIV感染者身上。经基因编辑的细胞在患者体内持续存活了一年多且未引起明显副作用，但细胞数量较少，不足以降低血液中HIV的病毒载量。

应用于诊断试剂的低成、本高效率等优势

2020年12月由杭州众测生物研发的新型冠状病毒 2019-nCov 核酸检测试剂盒（CRISPR 免疫层析法）获批，是国内首次批准利用 CRISPR 技术的新冠病毒检测试剂盒。

在IVD领域CRISPR技术相较于PCR技术有诸多优势：CRISPR诊断特异性极好，可以检测到一个碱基的突变，非常适合早期筛查肿瘤、检测肿瘤易感基因和致病基因。同时，CRISPR诊断技术操作简单、对仪器设备依赖性低、价格低廉，适合野外检测和不发达地区检测；例如国内某兽医科研单位基于CRISPR建立适合养殖场净化的诊断方法，刚果民主共和国利用CRISPR分子诊断技术检测埃博拉病毒。另外，CRISPR诊断对操作者的要求低、结果可视化，因此家庭用CRISPR诊断试剂盒也是许多公司发展的方向。

图：CRISPR分子诊断技术和PCR技术比较

资料来源：根据公开资料整理

构建新型模式动物

以前通过基因编辑的方法构建灵长类动物疾病模型几乎是不可能的事，而灵长类动物疾病模型对于医药研发非常重要。CRISPR/Cas技术诞生后，人们可以轻易的实现灵长类动物的基因编辑，从而构建出各种各样的疾病模型。

基因编辑的技术发展发展趋势

ZFNs和TALENs不断降低成本，缩短开发周期

相较于CRISPR，ZFNs和TALENs明显的缺点是构建复杂，开发周期长，成本高，未来弥补这方面的缺陷是这两种技术未来发展的主要趋势。ZFNs的领导者Sangamo表示，在过去，ZFNs的开发周期可能长达三个月，而确定最终治疗ZFNs通常耗时一年。经过改进后，开发周期已经缩短到10天，在此期间，细胞中的构建体被设计、组装和测试，最终生产治疗ZFN所需的总时间已经缩短至3个月。

CRISPR 基因编辑不受PAM限制，实现任意基因组位点编辑

CRISPR-Cas9有一个明显的短板，不能对不在 PAM 序列附近的基因进行编辑。为了克服这个障碍，由 MGH 基因组医学中心的生物化学家Benjamin P. Kleinstiver领导的研究小组，设计了一种 Cas9蛋白的变种，它不需要特定的 PAM 来结合和切割 DNA。这两种新的Cas9变种，分别命名为 SpG和SpRY，允许编辑 DNA 序列，其效率是传统的CRISPR-Cas9酶无法达到的。

克服脱靶率

ZFNs和CRISPR/Cas都会面临脱靶率高的问题。2016年，Sangamo 在Nature Communications上发表了一篇论文，他们开发了一个系统，可以选择以高比率在正确的位置切割基因的ZFNs，即使在非常高的靶向活性下，仍然保证脱靶率降至检测限水平或者更低。CRISPR/Cas脱靶率的高低关键在于gRNA的设计，gRNA和非目标区域过多的非特异性结果，脱靶效率较高，特别是靠近PAM的8-10bp不能和非目的区有高同源性。目前为了提高基因组编辑的准确性，对Cas9核酸酶进行了突变，突变后的Cas只能切割DNA双链中的一条链，通过两个gRNA引导Cas对DNA切割，可以显著提高基因组编辑的特异性，降低脱靶率。