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肌动蛋白调节剂hMENA调节GAS6-AXL轴和促肿瘤癌细胞/基质细胞合作

2021

05/13

古麻今醉

A-

A+

癌症的发生和进展一直是医学研究的热门主题，而癌症的发展、治疗和预后与癌细胞的特征息息相关。

肿瘤细胞和肿瘤相关的成纤维细胞（CAFs）之间的动态相互作用受多种信号通路的调控，这能导致癌症进展和治疗耐药性。研究证明了hMENA（Ena / VASP家族的肌动蛋白调节蛋白的成员）及其组织特异性异构体会影响许多与癌症进展相关的细胞内信号通路。2020年，Melchionna R等人在EMBO reports上发表了一篇题为《The actin modulator hMENA regulates GAS6-AXL axis and pro-tumor cancer/stromal cell cooperation》的文章，该研究报道了hMENA / hMENAΔν6异构体在促肿瘤CAFs和通过GAS6 / AXL轴调控的促肿瘤癌细胞/ CAF串扰中的新功能。现介绍如下：

LC-MS/MS蛋白质组学分析表明，过度表达hMENAΔν6的CAFs分泌AXL配体GAS6，有利于表达AXL的胰腺导管腺癌（PDAC）和非小细胞肺癌（NSCLC）细胞的侵袭性。相反，hMENA/hMENAΔν6在肿瘤细胞中调节AXL的表达，从而维持GAS6-AXL轴，这在EMT、免疫逃逸和耐药性中至关重要。在临床上，我们发现在PDAC和NSCLC中，高hMENA/GAS6/AXL基因表达特征与不良预后有关。我们认为hMENA通过旁分泌肿瘤与基质间的交互促进癌症进展，对NSCLC和PDAC具有深远的预后和治疗意义。以下将从五个方面来阐述hMENA与干扰肿瘤进展的具体研究结果。

1、hMENA/hMENAΔν6定义了一种促肿瘤CAF激活状态

我们评价hMENA及其异构体表达是否不仅在肿瘤细胞中发挥作用，而且在促肿瘤CAF生物学中也发挥一定作用。

我们从切除的原发性PDACs（P-CAFs）和NSCLCs（L-CAFs）中分离出CAFs。分离的CAFs表现出典型的梭形间充质细胞特征，并且缺乏原发肿瘤中发现的突变，这是通过对用于功能研究的所有CAFs的22个基因的NGS分析所揭示的。此外，CAF IF分析和qRT-PCR证实这些细胞表达CAF标记物（即FAP，PDGFRB），且EPCAM阴性。

hMENA异构体的特性清楚地表明，正如预期的那样，上皮性hMENA11a异构体（图1A）以及在癌细胞（EpPDAC）中表达的泛细胞角蛋白和 E-CADHERIN（图1）的CAFs均为阴性，并且被α-SMA和Pan-hMENA单克隆抗体免疫染色（图1A中的代表性病例PDAC#36）。

通过RT-PCR和WB分析证实的hMENA剪接的组织特异性，显示CAFs表达hMENA（88 KDa），以及间质特异性hMENAΔν6（80 KDa），但不表达hMENA11a（90 KDa）。

图1 hMENA异构体在CAFs中的表达

然后，我们比较了从移植捐赠者的正常胰腺组织（P-NFs）和P-CAFs成纤维细胞中hMENA/hMENAΔν6的表达水平。WB分析显示，在大多数评估病例中，这两种异构体在P-CAF中的表达水平均高于P-NF（图1B）。L-CAF与肺正常成纤维细胞（L-NF）（图1C）和离肿瘤核心至少5 cm远的非“肿瘤”组织的成对的“远端”成纤维细胞（L-DFs）相比，得到的结果相似。因此，除了来自PDAC腹膜转移的＃97外（图1B），hMENAΔν6在所有我们测试的非永久性CAF培养中均表达（图1B和C），尽管表达水平异质性。此外，我们能够从胰腺浆液性囊腺瘤＃71中分离出成纤维细胞，显示出非常低的hMENA/hMENAΔν6表达（图1B）。

图2 hMENA在PDAC和NSCLC组织肿瘤细胞和基质细胞中的表达

在原发性NSCLC组织的IHC分析中也证实了hMENA在基质中的异质性表达。为了证实过表达hMENA/hMENAΔν6的原发肿瘤组织中存在CAF，我们对Pan-hMENA和α-SMA抗体共染色的NSCLC和PDAC组织进行了共聚焦分析，结果显示Pan-hMENA修饰了α-SMA阳性的基质细胞，如预期的，也修饰了α-SMA阴性的肿瘤细胞（图2A和B）。

此外，在PDAC单细胞RNA-Seq数据中，我们证明，与其他基质细胞类型相比，hMENA在成纤维细胞和星状细胞中表达水平更高，但在免疫细胞中没有表达（图2C）。然而，与其他肿瘤细胞相比，hEMNA在Ductal 1细胞中的表达水平更高。同样，肺肿瘤微环境的单细胞RNA-Seq识别出不同的基质细胞亚型。通过该分析，我们收集到的结果是，与其他类型的基质细胞相比，成纤维细胞中hEMNA（ENAH）的表达水平更高（尽管簇间存在异质性）（图2D）。

图3 hMENA/hMENAΔν6调节促肿瘤CAF功能活性

为了进一步详细说明hMENA/hMENAΔν6的功能意义，我们通过在多个P-CAF和L-CAF以及P-NF和L-NF中进行功能实验，分析hMENA/hMENAΔν6的表达水平是否与CAF活性相关。我们发现，相对于P-NF和L-NFs，CAFs中hMENA/hMENAΔν6的高表达与胶原凝胶收缩能力（衡量基质重塑能力的一个指标）以及分泌和激活MMP-2能力相关。与正常原代成纤维细胞NFs相比，这些细胞中FAP表达的增加证实了CAFs的活化表型。

当我们在hMENAΔν6高表达的CAFs中使用三种不同的siRNA（sihMENA（t）），（PCAF#36；P-CAF#138；L-CAF#189；L-CAF#484，图1B和C）沉默所有hMENA异构体时，这种hMENA相关的CAF功能（图3）很明显。通过Matrigel transwell侵袭实验（图3A）发现SihMENA（t）降低了CAFs的侵袭能力，并激活了L-CAFs和P-CAFs中的MMP-2。此外，我们观察到与对照组相比，hMENA/hMENAΔν6沉默的CAFs中CAFs对胶原凝胶的收缩能力显著降低。

当我们在P-NFs和L-NFs以及低表达hMENAΔν6的CAF中过表达hMENAΔν6（P-CAF＃110和L-CAF＃400，图1B和C）时，我们发现非肿瘤成纤维细胞和低表达hMENAΔν6的CAFs增加了它们的功能活性（图3B）。

综上所述，这些数据首次表明了hMENA/hMENAΔν6作为促肿瘤CAF激活状态标志物的作用。

2、hMENA在肿瘤细胞与CAFs的协同作用中起着至关重要的作用

众所周知，CAFs在各种癌症中通过旁分泌信号的激活促进肿瘤进展和侵袭。

为了确定hMENA/hMENAΔν6表达是否影响旁分泌促侵袭通路，我们从P-NFs和P-CAFs中收集了条件培养基（CM）。根据WB分析中hMENAΔν6的表达情况，将其分为P-CAFhigh（hMENAΔν6表达高于NFs平均表达的2倍）和P-CAFlow（hMENAΔν6表达低于2倍;图1B）。我们评估了CM对PANC-1细胞侵袭性的影响，发现当用P-CAF-CM处理PANC-1 48小时后，癌细胞侵袭的增加与hMENAΔν6的高表达相关。的确，如图4A所示，与从P-CAFlow和/或NFs来源的CM相比，P-CAFshigh来源的CM具有更高的促侵袭效应（图4A），表明CAF-CM增加癌细胞侵袭的能力与hMENA/hMENAΔν6的表达有关。一致认为，当CAFs对hMENA/hMENAΔν6沉默时，它们的CM无法诱导 PANC-1和KP4PDAC细胞侵袭（图4B）。这些数据在H1975（图4C和D）和A549 NSCLC细胞中得到了证实。另外，沉默P-CAFs的CM也显示出降低诱导体外肿瘤细胞生长的能力。

这些结果表明hMENA/hMENAΔν6过表达确定了具有促肿瘤功能的CAFs亚群，能够通过调节旁分泌因子来调节肿瘤细胞的生长和侵袭。

图4 hMENA/hMENAΔν6介导肿瘤细胞与CAFs的相互对话

基于癌细胞与CAFs之间双向通信的相关性，我们检测了hMENA介导的CAF激活是否通过hMENA在肿瘤细胞中过表达而相互维持。我们首先用来自PANC-1细胞（高度表达hMENA/hMENAΔν6异构体）的CM处理P-NFs 24小时，然后评估了hMENAΔν6在P-NFs和P-CAF#110中的表达。我们发现肿瘤细胞源性分泌因子显著上调了hMENAΔν6，提示肿瘤源性分泌组能够诱导hMENAΔν6在NFs中过表达（图4E）。这种情况也发生在低hMENAΔν6水平（P-CAF#110）（图4G）和高hMENAΔν6水平（L-CAF#484）的CAF中。

为了深入了解肿瘤细胞中的hMENA/hMENAΔν6是否支持CAF激活，将CAF以transwell形式与对照PANC-1细胞（siCNT PANC-1）和/或与hMENA/hMENAΔν6沉默的PANC-1细胞（sihMENA（t）PANC-1）进行单培养或间接共培养。48小时后，我们观察到与单培养的P-CAFs相比，P-CAFs与对照肿瘤细胞（siCNT PANC-1）共培养增加了CAF的凝胶收缩能力（图4F）。与之相关的是，PANC-1中hMENA/hMENAΔν6表达的沉默抑制了CAF的激活，这可以从衍生自PANC-1沉默细胞的CM引发的CAFs的凝胶收缩能力降低来表明（图4F）。我们还发现来自PANC-1细胞(对照)的CM诱导了CAFs(#110低hMENAΔν6)中的hMENAΔν6和α-SMA表达，当我们沉默hMENA/hMENAΔν6 (sihMENA(t) PANC-1)时，这种作用被消除(图4G)。这些数据表明hMENA通过旁分泌因子调节CAF与肿瘤细胞之间的相互作用。

3、CAFs中hMENA/hMENAΔν6的表达通过GAS6调控癌细胞侵袭

为了鉴定可能解释CAFhigh和CAFlow之间的促肿瘤功能差异的分泌蛋白，我们对来自P-CAFhigh、P-CAFlow和P-NFs的CM进行了LC-MS/MS蛋白质组学分析。

我们鉴定出CM-NFs、CM-CAFlow和CM-CAFhigh蛋白分别为142，321和387个。

在所有CM样品中鉴定出的蛋白质中，共有102种蛋白质，与CM-NFs相比，CM-CAFhigh中有25种蛋白质上调，而与CM-CAFlow相比，CM-CAFhigh中有16种蛋白质上调。值得注意的是，其中10种蛋白质（即SYNC、CACNA1A、EPHA3、MUC16、SIK3、CDH13、GAS6、MYH9、ZBBF2和CCD37）是唯一由CM-CAF high分泌的，并被定义为hMENAΔν6相关蛋白（图5A）。

在鉴定的10种蛋白中，考虑到其受体AXL在耐药机制中的主要作用，我们重点研究生长阻滞特异性蛋白6（GAS6），该耐药机制主要由EMT介导，包括对ICB的耐药。

我们通过ELISA和qRT–PCR（图5B和C）验证了与P-CAFslow和P-NFs相比，P-CAFshigh高度分泌GAS6。不同的是，我们发现PANC-1细胞表达低水平的GAS6（图5D），这与之前的数据一致，表明GAS6作为基质源性因子参与促肿瘤旁分泌介导的通信作用。

我们还发现，与L-DFs相比，L-CAFs中GAS6的表达显著增加（P=0.0208）（图5E），这与我们在PDAC成纤维细胞中的LC-MS/MS蛋白质组学分析一致。

然后我们通过分析沉默hMENA/hMENAΔν6表达的P-CAFs和L-CAFs中的mRNA表达，探讨了hMENA/hMENAΔν6在GAS6调控中的作用。如图5F、G所示，hMENA/hMENAΔν6沉默显著降低了P-CAFs和L-CAFs中GAS6的mRNA表达。另一方面，GAS6沉默并不影响hMENA/hMENAΔν6的表达。

图5高hMENAΔν6 CAFs可分泌癌细胞侵袭所需的GAS6

更进一步，我们提出疑问hMENA/hMENAΔν6在CAF驱动的肿瘤细胞侵袭中的作用是否依赖于hMENA调节GAS6分泌的能力。为此，我们用GAS6表达沉默的P-CAFs衍生的CM处理PANC-1 48小时，我们观察到CAFs中的GAS6沉默减少了肿瘤细胞的侵袭（图5H），与CAFs中的hMENA/hMENAΔν6沉默作用相同（图4B和D）。在L-CAFs中也获得了这种促侵袭由CAF衍生的GAS6。

重要的是，将重组GAS6（rGAS6）添加到hMENA（t）沉默的CAFs中可以拯救PANC-1的癌细胞侵袭性（图5H）。这些数据表明，hMENA/hMENAΔν6在CAFs中调节GAS6的表达和分泌，进而调控CAF介导的癌细胞侵袭。

4、hMENA/hMENAΔν6调控肿瘤细胞中AXL的表达并维持旁分泌GAS6-AXL介导的肿瘤细胞/CAF促侵袭协同性

受体酪氨酸激酶AXL的GAS6依赖性激活已被证明可增加入侵功能。我们最近报道了hMENA/hMENAΔν6在ET-1/β-arr1诱导的侵袭活性和卵巢癌侵袭性中发挥关键作用。

为了明确hMENA在肿瘤和CAF细胞促侵袭协同性中的作用，我们首先检测了hMENA是否调节肿瘤细胞中AXL受体的表达。我们发现，沉默hMENA（sihMENA（t））降低了PANC-1（图6A）和KP4 PDAC以及A549（图6A）H1650、H1975 NSCLC中的AXL蛋白水平。PANC-1和A549细胞的mRNA水平也出现了这种减少（图6B）。为了评估hMENA沉默对AXL基因转录的影响，我们在siRNA转染后72小时，用qRT-PCR法从siCNT和sihMENA（t）PANC-1和A549细胞系分离的总RNA中测定了总AXL mRNA和AXL前体mRNA。如图6C所示，hMENA沉默细胞中的前体mRNA和成熟mRNA AXL水平均下降，表明hMENA在转录水平上调控AXL（图6C）。hMENA（t）沉默的癌细胞对AXL表达依赖的BGB324激酶抑制剂（R428）敏感性的降低进一步证实hMENA沉默诱导了AXL的下调。然而，在一组癌细胞系中，BGB324并没有影响hMENA的表达。

为了研究hMENA在配体依赖的AXL信号通路中的作用，我们用rGAS6处理PANC-1细胞，我们发现hMENA沉默抑制了GAS6介导的AXL和AKT磷酸化（图6D），并通过Matrigel transwell侵袭实验检测到癌细胞对GAS6的侵袭减少（图6E）。因此，这些数据也在NSCLC细胞系H1975中得到了验证。值得注意的是，根据CAF衍生的GAS6对PANC-1的促侵袭作用（图5H），当用CAF-CM处理后，hMENA沉默的肿瘤细胞侵袭性更小（图6F）。这些数据表明hMENA通过调控GAS6/AXL旁分泌轴，在癌细胞与CAFs之间的通信中发挥了重要的促侵袭作用。

图6 hMENA/hMENAΔν6沉默抑制癌细胞中AXL的表达和活性

5、hMENA，AXL和GAS6的联合表达是胰腺腺癌和肺鳞癌患者预后差的相关基因标志

为了明确我们的实验数据在临床实践中的相关性，我们研究了ENAH（hMENA）、AXL和GAS6 mRNA联合表达水平在胰腺癌（PDAC）患者（n=172）、肺鳞癌（LUSC）患者（n=501）和肺腺癌（LUAD）患者（n=516）中的预后价值。

有趣的是， 3-基因（ENAH、AXL和GAS6）的表达特征与PDAC总生存期（OS）预后更差相关，并根据特征表达对患者进行分层（图7A左），相反，未发现1基因特征（ENAH）（图7A右侧）或2基因（AXL和GAS6）表达特征（图7A中部）与预后有相关性。值得注意的是，3基因特征表达升高，而不是1或2基因的特征表达，与较短的疾病特异性生存（DSS）也有相关性，强调这三个基因在PDAC中的临床相关性，并表明ENAH与AXL和GAS6联合表达赋予该基因特征的预后价值。

在LUSC患者（OS 80个月）中发现3基因表达特征（图7B左）相似的预后相关性，而不是1或2基因表达特征（图7B中、右）。

图7 hMENA、AXL和GAS6的联合表达与PDAC和NSCLC的生存降低相关

总之，这些结果确定了3-基因（ENAH、AXL和GAS6）的表达特征作为PDAC和LUSC患者侵袭性疾病的预后指标，并加强了肿瘤细胞和CAFs中hMENA表达模式分析的临床相关性。

讨论

我们提出抑制肌动蛋白细胞骨架调节蛋白hMENA可能会中断癌细胞与CAFs之间的通信，从而通过调节GAS6/AXL轴抑制肿瘤侵袭性，并影响PDAC和NSCLC患者预后。

我们之前的研究数据表明hMENA/hMENAΔν6参与侵袭性细胞的成熟和介导癌细胞的侵袭，在此我们证明了hMENA调控RTK AXL的表达，该RTK AXL参与了侵袭性细胞的形成。相应地，我们发现hMENA/hMENAΔν6 在CAFs中调节AXL配体GAS6的表达和分泌，表明hMENA在由癌细胞与CAFs之间协同作用介导的肿瘤侵袭性中是一个关键角色。

我们发现hMENA/hMENAΔν6在正常成纤维细胞中表达水平很低，而在活化的CAFs中高度表达（图1B和C，以及图3）。在原代PDAC和NSCLC组织中，hMENA/hMENAΔν6在CAF中表达（图2 A和B），以单细胞分辨率描述的基质细胞综合目录中的数据证明了这个结果，hMENA仅在CAFs中表达，在免疫细胞中不表达（图2C和D）。

通过分析“ Navab数据集”发现，与低hMENA表达的CAFs相比，高hMENA表达的CAF亚组α-SMA和FAP表达增加。考虑到hMENA在肌动蛋白动态调节中的主要作用，我们认为hMENA并不是识别特定的CAF亚型，而是反映促侵袭功能的CAF状态。事实上，我们证实了hMENA/ hMENAΔν6的沉默降低了促肿瘤CAF的功能。相反，hMENAΔν6异构体在正常成纤维细胞中过表达导致CAF激活（图3B），进而导致癌细胞侵袭（图4A–D）。

我们假设hMENA/hMENAΔν6高表达的 CAFs的分泌组中主要是促侵袭因子，通过LC-MS/MS蛋白质组学分析，鉴定出一系列定义hMENAΔν6相关特征的蛋白（即SYNC、CACNA1A、EPHA3、MUC16、SIK3、CDH13、GAS6、MyH9、ZBBF2和CCD37）（图5A）。

研究表明GAS6是参与旁分泌基质-肿瘤细胞相互作用的关键因子，并且GAS6-AXL轴参与了KRASG12D突变诱导的PDAC与基质细胞之间的相互信号传递。因此，我们深入分析了hMENA是否积极参与GAS6-AXL通路的调控。我们的兴趣还取决于这一轴在耐药性中的相关性，主要通过EMT、免疫抑制和最近的适应症将AXL靶向化合物与免疫检查点抑制剂相结合进行调解。我们的数据表明，在CAFs中沉默hMENA/hMENAΔν6降低了GAS6的表达和分泌，从而抑制了CAF诱导的癌细胞侵袭性（图5B、C、F、G、H），这与最近的一项研究一致，即CAF衍生的GAS6可以激活AXL，促进肿瘤细胞迁移。基于生物学和临床意义，我们报道了hMENA/hMENAΔν6在GAS6/AXL轴调控中发挥双重作用。事实上，hMENA的表达不仅促进了CAFs中GAS6的分泌，还调节了肿瘤细胞中AXL的表达和GAS6介导的AXL激活（图6A-E）。我们之前已经证明了hMENAΔν6在RNA和蛋白水平上调节波形蛋白的表达，并且EMT诱导波形蛋白与AXL表达的上调相关。

虽然hMENA在AXL表达调控中的确切作用仍有待充分阐明，但我们已经发现，hMENA沉默降低了总mRNA和AXL 前体mRNA的表达水平，表明hMENA对AXL转录有贡献（图6C）。

功能上,肿瘤细胞中hMENA/hMENAΔν6表达的下调抑制了GAS6诱导的癌细胞侵袭性，表明hMENA在肿瘤细胞和CAFs中的表达可能增强了旁分泌GAS6-AXL轴。

临床上，在PDAC和NSCLC的大量临床样本中，整合的ENAH/AXL/GAS6高表达水平与不良预后呈正相关（图7A和B），为PDAC和NSCLC进展提供了一个新的预测指标。

从治疗的角度来看，hMENA能够调节促肿瘤CAF激活，并且它们与肿瘤细胞的相互作用使该蛋白及其组织特异性剪接异构体成为癌症治疗的吸引靶点。

“论肿道麻”点评

癌症的发生和进展一直是医学研究的热门主题，而癌症的发展、治疗和预后与癌细胞的特征息息相关。众所周知，癌细胞和非癌器官特异性细胞之间的相互作用会影响肿瘤的发展。许多研究指出癌细胞/CAF相互作用以及它们激活的相对自分泌和旁分泌信号传导对于肿瘤的进展具有重要影响。然而，存在一部分因素能够驱动恶性细胞程序和CAF细胞相互重新编程，这具有重要的治疗意义。从细胞骨架动力学的层面看，细胞与细胞间或者细胞内存在一系列的物质如肌动蛋白调节剂hMENA可能会影响到细胞间的通讯，进一步影响到肿瘤的侵袭性，进而影响肿瘤的预后。从诊断的角度来看，通过检测一些蛋白的表达或者基因片段，可对某种肿瘤的预后进行更准确的预测，而从治疗的角度来看，通过干预这些蛋白的表达或者应用该蛋白的组织特异性剪接异构体，从而干预该蛋白与肿瘤细胞间的相互作用，达到治疗的目的。这为我们对癌症的研究和治疗提供了新的思路。

编译：吴佳旻，述评：孙志荣

审校：张军，缪长虹

原始文献：The actin modulator hMENA regulates GAS6-AXL axis and pro-tumor cancer/stromal cell cooperation. Melchionna R, Spada S, Di Modugno F. et al. EMBO Rep, 2020; 21(11): e50078. doi: 10.15252/embr.202050078. Epub 2020 Nov 5.