cMet/EGFR 双特异抗体Amivantamab的筛选策略

Amivantamab的生产采用了DuoBody®双特异抗体平台——为了降低两个抗体在Fab-arm交换过程中形成同源二聚体，其中MET抗体的CH3区域进行F405L突变，EGFR抗体的CH3区域进行K409R突变；而双特异性抗体的生产采用了cFAE（Controlled Fab-arm exchange）技术：两个单克隆抗体先分别在两个细胞株中进行生产，并进行纯化。纯化后的两个单克隆抗体在体外按照一定比例混合后经过还原和氧化处理后形成异源二聚体双特异抗体（图1A）。

图1：Amivantamab的生产和筛选策略

Amivantamab的筛选采用淘汰机制的方法，主要从抗体与靶标蛋白的亲和力大小，抗体是否引起靶标蛋白的磷酸化以及抗体对癌细胞是否抑制生长等方面进行（图1B）。接下来我们一一介绍其筛选的原理和方法。

初始筛选中共有5个抗Met的单克隆抗体和8个抗EGFR的单克隆抗体。为了检测这些抗体的单价亲和力，这些抗体与b12抗体（靶向HIV膜蛋白的抗体）组合成1+1的双特异抗体，并利用表达Met和EGFR的细胞检测抗体的亲和力，对于结合能力EC50大于1ug/ml的抗体，被认为是亲和力较弱的抗体，因此会被淘汰。检测结果表明，抗MET的5个抗体的亲和力都满足要求，而抗EGFR的抗体中，仅有4个满足要求（图2A）。

图2：抗体盘及亲和力，磷酸化筛选

为什么要检测抗体对MET的磷酸化，这是因为部分MET抗体可呈现为激动型抗体，其结合MET后可以诱导MET蛋白的二聚化，而MET通路的激活需要该蛋白的二聚化，因此有该功能的抗体在体内激活MET相关通路，进而可能促进癌细胞的增值。MET二聚体形成后，其位于胞内的酪氨酸蛋白激酶PTK结构域也会激活，激活的PTK使c-Met位于β链胞内激酶活性区内的Tyr1234和Tyr1235两个磷酸化位点发生磷酸化，并进一步导致位于C末端的Tyr1349和Tyr1356磷酸化，最终导致肿瘤的生长，转移等（图3）。

图3：MET结构和HGF/MET信号通路（参考文献2） 

抗体筛选中检测抗体对MET的磷酸化可以避免抗体对MET通路的激活，从而防止抗体药效的折损。5个MET抗体和8个EGFR抗体根据两两配对原则，组合成40个双特异抗体分子进行MET磷酸化检测（图2C），其中双价MET抗体5D5为阳性对照，单价MET 抗体5D5 x b12为阴性对照。根据磷酸化程度对不同双特异抗体进行打分（图2B和2C）并舍弃磷酸化分数大于等于3的双特异抗体。

实验结果表明，所有EGFR单克隆抗体无法促使MET磷酸化，包括b12抗体；而所有MET单克隆抗体都可以使MET磷酸化，但是单价的MET抗体几乎不会促使MET磷酸化（图2C MET x b12双抗）。

前两轮的筛选已经排除了亲和力比较弱或者能够促进MET磷酸化双特异性抗体（含有EGFR抗体A，C，D，G和F的双特异抗体）。癌细胞增值抑制实验是为了检测双抗是否可以抑制癌细胞的生长增值，从而排除无法抑制癌细胞生长或者促癌细胞生长的抗体。该筛选在KP4（HGF驱动的细胞生长）和H1957（EGFR信号通路驱动的细胞生长）细胞上进行。

KP4抑制性结果表明，含有MET A, MET B 和 MET C的双抗能够有效的抑制细胞的生长，而含有MET D 和 MET E的双抗无法抑制癌细胞的生长，这可能是因为MET D 和 MET E无法阻断HGF与MET的结合（图4A）。

H1975抑制性实验结果表明只有含有EGFR-H的双抗和阳性对照双价EGFR H IgG可以有效抑制癌细胞的生长（图4B）。

NCI-H441细胞（同时表达相同密度的MET和EGFR）增值实验证明，MET A x EGFR B, MET A x EGFR E, MET A x EGFR H, MET D x EGFRB和 MET D x EGFR H双抗可以促进癌细胞的生长（图4C）。因此这几个双抗也就被淘汰。

图4：双特异抗体抑制癌细胞的生长及抑制EGFR磷酸化检测 

NCI-H441细胞实验结果（图4C）表明，虽然抗体无法通过MET靶点的磷酸化促进癌细胞的生长，但是可能会通过EGFR靶点的磷酸化促进细胞的生长。为了检测候选抗体的抑制EGFR磷酸化的能力，作者利用EGF蛋白刺激A549细胞，结果表明（图4D），作为阳性对照的EGFR单克隆抗体可以完全抑制EGFR的磷酸化，候选双抗MET A x EGFR H 和MET B x EGFR H同样可以完全抑制EGFR的磷酸化，但是MET C x EGFR E无法完全抑制EGFR磷酸化。

通过亲和实验排除亲和力EC50大于1ug/ml的EGFR A,C,D,F和G。在癌细胞增值抑制实验中，仅含有EGFR H的双特异抗体可以抑制H1975细胞的生长，因此排除了EGFR B和EGFR E（图4B）。含有MET C的双特异抗体中，当EGFR抗体的亲和力EC50<1ug/ml时，抗体可以促进MET的磷酸化（图2C），因此MET C抗体被舍弃；细胞增值抑制实验中，含有MET D 和MET E的双特异抗体几乎无法抑制KP4癌细胞的生长，因此也被舍弃（图4A）；在NCI-H441细胞实验中，含有MET A和MET D的双特异抗体有促进细胞生长的趋势（图4C），因此也被淘汰。

综合以上实验结果，只有MET B x EGFR H 双特异抗体满足要求，因此，该双抗作为候选分子进行进一步研究，这就是在一期临床大放异彩的Amivantamab抗体。

MET B抗体的Fab和MET Sema-PSI结构域的晶体结构表明，MET B抗体的所有CDR区(除CDR H1外)都参与了与抗原的结合。抗体与MET Sema相互作用的位点如图5B所示。抗体抗原晶体复合物结构表明，MET B抗体结合MET后，抗体的轻链会阻碍HGF β-链与MET的结合（图5D）从而阻止MET的信号通路的激活。

图５：Amivantamab中单臂MET 抗体和MET Sema-PSI晶体结构

表位鉴定和点突变实验表明，Amivantamab抗体主要结合于EGFR的第三结构域（图６），其主要的结合位点包括K443, K465, I467, 和S468，这些位点位于TGF与EGFR结合的边缘，抗体结合这些位点后一定程度上阻碍了TGF与EGFR的结合，进而阻断EGFR相关通路的激活。

图６：Amivantamab中单臂EGFR抗体与EGFR结合的结合位点

本文章纯粹从技术的角度阐述了Amivantamab双特异抗体筛选的过程，40个候选分子通过亲和力，磷酸化，抑制细胞生长等方面层层筛选，最后得到了理想的候选分子Amivantamab。虽然工作量不如已经上市的双特异抗体emicizumab（靶向凝血因子X和因子IXa），但是其筛选思路相当明确——阻断MET和EGFR相关信号通路的激活，进而抑制肿瘤细胞的生长。

该文章的筛选过程也让我们意识到双特异抗体并不是任意两个不同靶点的单克隆抗体的随意整合，而且并不是两个单克隆抗体组合成双特异抗体就会有1+1>2的效果。一个好的双特异抗体的筛选要从机制出发，要有坚实的理论支撑，只有这样才可能具有好的药效。由此联想到国内双特异抗体研发的现状，多数公司看到国外某个双抗药在临床有较好的效果，就快速的跟进开发相同靶点或者类似的药，可能只是比葫芦画瓢，而没有深刻理解药物的作用机理，仅仅做到了形似神不是，而结局大概率只是竹篮打水一场空！

作者：大脸猫

审阅：陈梓榕

编辑：张琳