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中科院 | SBB：宏基因组学揭示了氮循环微生物特定类群对长期施氮的响应机制

2021

06/05

微生态

A-

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过量施氮会严重影响农业生态系统中土壤微生物的氮循环过程。然而，目前尚不清楚长期施氮如何影响氮循环功能微生物的变化。

编译：微科盟温水，编辑：微科盟木木夕、江舜尧。

微科盟原创微文，欢迎转发转载。

导读

过量施氮会严重影响农业生态系统中土壤微生物的氮循环过程。然而，目前尚不清楚长期施氮如何影响氮循环功能微生物的变化。为此，我们利用宏基因组测序（Metagenomics Sequencing）结合氮循环基因靶向装配（Gene-targeted Assembly，Xander法）技术，研究了长期施氮（20年）对华北平原氮循环微生物群落的影响。我们发现长期施氮显著提高了大多数氮循环过程下的微生物丰度，但降低了固氮过程的微生物丰度。对某些氮循环功能基因而言，虽然其丰度没有明显变化，但其对应的功能微生物群落组成明显改变。参与同一氮循环过程的微生物菌群的相对丰度与分别与不同的土壤理化性质显著相关，表明氮循环微生物间存在生态位分离。我们的研究结果还表明，具有丰富的氮循环功能菌群（基因型相同但菌群对施氮的响应不同）对于维持复杂环境条件下的土壤氮循环十分重要。本研究证实了宏基因组测序结合功能基因靶向装配技术为实现特定功能基因的“大海捞针”提供了有力支持。

论文ID

原名：Metagenomics reveals taxon-specific responses of the nitrogen-cycling microbial community to long-term nitrogen fertilization

译名：宏基因组学揭示了氮循环微生物特定类群对长期施氮的响应机制

期刊：Soil Biology and Biochemistry

IF：5.795

发表时间：2021.03.16

通讯作者：刘彬彬

通讯作者单位：中国科学院遗传与发育生物学研究所

实验设计

主要内容

当前，全球农业生态系统中氮肥投入过量，其中50%以上最终进入环境中。中国消耗了全球近三分之一的合成氮肥，并且氮素利用率很低。农业生态系统中氮的流失已经导致一系列的环境问题，如：地下水硝酸盐污染，土壤酸化，温室气体排放增加等。微生物对土壤中氮素的周转至关重要。部分研究显示施氮与土壤微生物群落结构存在一定的相关性。但是，这些研究都基于PCR扩增的实验方法，该方法具有碱基偏好性，且对目的基因的检测种类有限。相比之下，宏基因组测序对生态系统中微生物群落的检测结果更为准确。近几年来，尽管宏基因组测序的成本有所下降，但是在土壤生境中微生物的多样性过高，测序结果通常只获得部分片段化的基因，对这些基因的组装仍然是一个挑战。这对于肥沃的农业土壤则更甚。基因靶向宏基因组组装的方法，可以组装全长或接近全长的目的基因及其基因组，为利用宏基因组测序探索功能基因的遗传信息提供了新的策略。

在本项研究中，我们使用了Xander法，以功能基因做靶向装配，探讨施氮对华北平原（中国典型农业集约化地区）氮循环微生物群落的影响。研究基于20年大田实验平台，设置了4个梯度的氮肥（尿素）水平，分别为0、200、400和600 kg N ha^-1 yr^-1，各3个重复。实验地详细信息见补充材料。从各小区采集土壤样品后，使用于 FastDNA试剂盒提取土壤总DNA，由上海Genery Bio公司在Illumina HiSeq平台进行宏基因组测序。结果共获得390823147个净序列（样本平均序列数为32568596），读长为150 bp（表S1）。用Xander工具对1个系统发育相关基因（ rpl B）和12氮循环基因（ureA、nifH、amoA、napA、narG、nirK、nirS、norB、cNor、 nor B cNor、norB qNor、nosZ、非典型 nosZ1和非典型nosZ2）进行组装和注释。以rplB基因丰度为基准，将其他各基因的丰度归一化为10k。宏基因组序列组装、注释和统计分析的相关结果见补充材料。

结果表明，长期施氮提高了大多氮循环功能基因的丰度；但nifH基因的丰度明显降低（图1A），这表明长期施氮会导致微生物群落的演替，与尿素分解、硝化和反硝化过程相关的微生物丰度增加，而与固氮过程相关的微生物丰度减少。值得注意的是，尽管 nirS和nirK基因都编码亚硝酸盐还原酶，它们对氮（尿素）添加的反应却不同：nirK基因丰度随氮肥用量的增加而增加，而nirS基因丰度没有明显变化（图1A）。这一结果表明，在本实验条件下，相较nirS基因，nirK基因对施氮更为敏感。非典型 nos Z基因（包括nosZ1和nosZ2）的丰度远高于典型nosZ基因，而该基因在我们先前基于PCR的方法中未被扩增出来（图1A）。自非典型 nos Z基因被发现后，其在各生境中都被发现要高于典型nosZ基因的数量，这表明具有非典型nosZ基因的微生物可能对土壤温室气体N₂O的贡献更大。另外，本研究发现，典型nosZ和非典型nosZ基因丰度对施氮的响应不同，这进一步表明了两种微生物的生态位分离或者说它们对环境的适应性不同。

图1. （A）不同处理下各功能基因的相对丰度（每10000个细胞的基因数）。柱子右侧的字母代表不同处理间的差异（Kruskal–Wallis秩和检验，P<0.05）。nosZ a1和nosZ a2代表非典型nosZ功能基因的两个亚型。（B）各类型功能菌在门水平上的分布。（C）不同处理下微生物群落的NMDS图。

本研究的 12个功能基因最终被鉴定为23个门（图1B）。不同功能基因的微生物分布不同，例如，narG和非典型nosZ2 基因分别鉴定到 10和12个门；但是，amoA、norB cNor和典型nosZ基因则只鉴定1个门。我们利用非度量多维度法（NMDS）分析了不同施氮水平下各功能性基因的微生物群落的分布（图1C），结合多响应置换程序分析（MRPP），结果显示施氮与不施氮下土壤的氮循环微生物群落结构具有显著差异（P<0.05，表S2），这表明施氮水平是影响氮循环微生物群落关键因素。

值得注意的是，在长期施氮下，某些基因（如nirS和napA）的丰度没有显著变化（图1A），但是该基因对应的一些菌群却有显著变化（图2，图S1）。介导同一氮循环过程的不同菌群可能具有不同的活性和环境适应性。例如，先前的研究表明，某些氨氧化细菌（ AOB）：比如，Candidatus Nitrosoglobus terrae菌株偏好酸性土壤，而Nitrosolobus sp. TCH716菌株偏好碱性土壤。此外，在氨氧化细菌（AOB）菌株中发现氨氧化速率对亚硝酸盐（亚氨氧化的有毒产物）的响应不一致。这些结果表明，施氮对该氮循环功能基因（如nirS和napA）的影响并非体现在基因丰度的变化上，而是体现在相应功能微生物类群的变化上。因此，同一功能基因下不同菌群对环境适应性的差异可能会影响（掩盖）特定菌群对氮肥添加的反应，而仅基于基因丰度水平的研究忽略了这种情况。

图2. 优势属的丰度变化热图。红色箭头表示该处理下的物种丰度显著高于对照未施肥处理（ N0），绿色箭头表示该处理的物种丰度显著低于对照未施肥处理（N0）。气泡图显示了主要属和土壤性质之间的相关性（Spearman相关系数）。TC：总碳；TN：总氮；SOM：土壤有机质；NH₄⁺-N：铵态氮；NO₃^--N：硝酸盐氮。

在本研究中，我们发现了同一功能基因下不同类菌群的微生物可以共存（图 1B和2），并且这些菌群对施氮的反应各不相同（图2，图S1），这说明该基因存在功能冗余。Louca等人对微生物系统中的功能冗余做了全面阐述。在较高的施氮量下，napA-Bradyrhizobium spp. 菌的相对丰度增加，而napA-Azospirillumspp.菌的相对丰度减少（图2，图S1）。napA-Bradyrhizobium spp.菌丰度与土壤C/N比、pH呈正相关，与全氮(TN)、有机质(SOM)呈负相关；napA-Azospirillum spp.菌丰度与全氮(TN)、C/N比呈正相关，与土壤pH、硝酸盐(NO₃^--N)含量呈负相关(图2)。同一基因下的微生物丰度与不同土壤性质之间存在显著的相关性，表明环境条件对土壤微生物的功能冗余有强烈的影响。由于功能冗余可能会提高微生物群落的稳定性和抗干扰能力，因此在复杂变化的环境条件下，具有广泛的环境适应能力（高度的功能冗余）的微生物类群可能对维持土壤氮循环十分重要。

结论

本研究利用无PCR偏好性的宏基因组测序技术，对氮循环功能基因直接进行组装和注释，结果发现，长期施氮对氮循环微生物群落有显著影响。对这些特定响应类群的研究有助于加强我们深入理解——氮肥添加对氮循环微生物群落的影响，这对集约化程度较高的旱地农田极为重要。