直接免疫组化的原理与优势

什么是直接免疫组化？要想了解直接免疫组化，首先我们得知道免疫组化的概念，免疫组织化学（immunocytochemistry, IHC）：又称免疫细胞化学，应用免疫学及组织化学的原理，对切片中的某些化学成分进行原位显示的技术。具体来说就是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使抗体上的标记物（荧光素、酶、金属离子、同位素等） 显色来确定细胞内抗原的成分（主要是多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量研究的一项技术。

其次我们再来了解一下免疫组化的历史和分类，在免疫组化的发展历史过程中，衍生出了几个大类。下面我们就时间线依次罗列：

1. 免疫荧光法：1941年，COONS等用荧光素标记抗体，检测肺炎双球菌在肺组织内的分布，由此开创了免疫荧光化学的新篇章。它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检测细胞或组织内的相应抗原，在荧光镜下观察。当抗原抗体复合物中的荧光素受到激发光的照射后即会发出一定波长的荧光，从而确定组织中某种抗原的定位，进而还可以进行定量分析。

2. 免疫酶标法：1968年，随着电子显微镜的广泛应用，日本学者中根一惠、Nakane等用酶代替荧光素标记抗体，开辟了免疫酶化学之路。其原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行定位研究。免疫酶标技术定位准确、对比度好、染色标本可以长期保存。因此，细胞电镜的发展是非常迅速的，已衍生出多种标记方法，像是ABC法、SP法、Envisoin法。

3. 免疫胶体金技术（免疫金属技术）：1971年Faulk 和Taytor将胶体金引入免疫组织化学，此后免疫胶体金技术作为一种新的免疫学方法，在生物医学各领域得到了日益广泛的应用。免疫胶体金技术是以胶体金这样一种特殊的金属颗粒作为标记物。胶体金是指金的水溶胶，它能迅速而稳定地吸附蛋白，对蛋白的生物学活性则没有明显的影响。因此，用胶体金标记一抗、二抗或其他能特异性结合免疫球蛋白的分子（如葡萄球菌A蛋白）等作为探针，就能对组织或细胞内的抗原进行定性、定位，甚至定量研究。由于胶体金有不同大小的颗粒，且胶体金的电子密度高，所以免疫胶体金技术特别适合于免疫电镜的单标记或多标记定位研究。由于胶体金本身呈淡至深红色，因此也适合进行光镜观察。如应用银加强的免疫金银法则更便于光镜观察。

4. 放射自显影技术：是利用放射性同位素的电离辐射对乳胶（含AgBr或AgCl）的感光作用，对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量研究的一种细胞化学技术。放射自显影技术用于研究标记化合物在机体、组织和细胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用机理、作用部位等等。

根据免疫组化的染色步骤：可分为直接法（又称一步法）和间接法（二步、三步或多步法）。

今天我们要说的就是免疫酶标法里面的直接法，其原理如图所示（图1），直接免疫组化染色跟常规免疫组化染色一样，其作用主要用于对不同组织来源肿瘤的鉴别诊断，它不同于我们科室现在再用的Evision二步法（图2），它采用的是一步法，且应用于新鲜组织，其染色时间更短，能够在术中冷冻病理检查的过程中来确定肿瘤性质、确定淋巴结是否有转移等。

图1.直接法原理

图2.Envision二步法原理

单从图1图2图示可见，常规的依托石蜡组织的二步法要比一步法灵敏性更高，它的二抗多聚酶复合物对显色效果起到了级联放大的作用。我们在这里说的一步法是贵州美鑫达公司开发的专门针对术中快速冰冻的免疫组化染色技术，它要求时限性，准确性。它通过聚合的HRP（辣根过氧化物酶）直接缀合到一抗上，是一种更简单、更快速的IHC程序，可最大限度地缩短时间和工作流程步骤。并就此开启了一系列新的临床应用，包括术中手术。可使用新鲜的冷冻组织，10分钟左右完成检测。（图3）

图3.直接法（纳米超敏HRP）原理

冰冻切片技术已普遍用于解决手术中的快速诊断问题，其特点为病理诊断快速，一般在30min内即可对送检组织做出正确的病理诊断，其误诊常与标本取材有限或不当，切片过厚、过碎，染色不佳， 或细胞形态不典型有关，为提高诊断率，常需进行免疫组化染色。常规石蜡切片免疫组化染色大多数抗原都必须进行抗原修复，而冷冻切片组织新鲜，没有进行任何化学处理，抗原封闭的途径不存在，因而可以省略抗原修复这一步骤。

正是由于该技术的出现，再加上术中冷冻技术的局限性，以及某些肿瘤细胞HE染色形态上的相似性，还有单靠术中冷冻组织HE染色明确诊断困难较大，易漏诊、误诊，造成患者的二次手术或医疗事故等。贵州美鑫达公司为我们提供了两种方案，手工和机器染色。其染色时间都可以控制在10分钟左右。机器染色还可以兼顾HE染色、几乎同时染好HE组织片和免疫组化的组织片，合理有效的节省了术中快速诊断的宝贵时间。（图4）（图5）

图4.免疫组化自动染色仪的独创性

图5.免疫组化自动染色仪的优越性

现在，已有很多关于快速免疫组化染色的文献，在我们术中冰冻的工作中，我科室选用贵州美鑫达的抗体，验证性的找了肺腺癌的病例进行相关染色，（图6、7、8）符合诊断标准。

图6.冰冻切片病理号：S2107230，选用抗体：TTF-1，诊断：肺浸润性腺癌，视野：10X

图7.冰冻切片病理号：S2107230，选用抗体CK7，诊断：肺

浸性腺癌，视野：10X

图8.冰冻切片病理号：S2107230，选用抗体CK8/18，诊断：肺浸润性腺癌，视野：10X

由染色结果可见，验证性染色的结果满足诊断要求，TTF-1 在该肺腺癌中肺的上皮细胞中呈阳性表达，CK7和CK8/18 在肺的上皮细胞中强烈表达。

当然，术中快速免疫组化染色也存在不可回避的缺陷，术中冷冻组织由于未经脱水、浸蜡等步骤，各组织成分软硬程度不一，影响切片完整度；切片过程中由于缓慢冻结或者冷冻时间过长等原因，易造成组织细胞内外冰晶及核内冰晶的产生，进而导致组织抗原的弥散，影响阳性定位和后续判读；贴片后不能进行烤片， 组织和玻片之间贴合仅靠温差作用和部分电荷作用，组织切片在后续的持续浸泡、冲洗过程中也容易造成织脱片、弥散等现象，因此，在工作过程中需要克服以上难点。