文献精读 | TLR4-MyD88信号通路参与子宫内膜异位症相关疼痛的发生发展

    子宫内膜异位症(EM)是一种常见雌激素依赖性疾病，即子宫内膜组织出现在子宫以外部位。目前全球约1.76亿女性患有子宫内膜异位症。EM标志症状是异位内膜病变组织周围出现的慢性疼痛，当前常用治疗方法包括给予止痛药、激素、手术和生育治疗。然而，以上治疗方式疗效并不令人满意且通常有副作用。因此，深入了解EM疾病中疼痛的发病机制和开发更有效的治疗方法是必要的。

     高迁移率族蛋白1(HMGB1)作为促炎介质，是Toll样受体(TLRs，包括TLR2、TLR4和TLR5)的内源性配体。前人报道认为HMGB1可能通过激活TLR信号引起痛觉过敏。在固有免疫中，TLRs是外界病原体的“感受器”，TLR4通过识别病原体相关分子模式以调控下游炎症级联反应来保护宿主细胞。近期研究表明，HMGB1和TLR4结合后诱导招募感觉神经元和神经胶质细胞中的髓样分化因子88（MyD88）和NF-κB因子，该过程与多种类型的疼痛机制相关。神经损伤也能通过HMGB1-TLR4-MyD88信号通路引起背根神经节（DRG）的神经炎症。在脊髓背角（SDH）中，TLR4阳性的星形胶质细胞和小胶质细胞会引起中枢敏化，并产生多种细胞因子诱导疼痛持续发生。

     因此，本研究推测子宫内膜异位症由于DRG和SDH中的HMGB1-TLR4-MyD88信号通路被激活，从而促进了相关疼痛的发生发展，并探讨是否能够通过阻断TLR4和MyD88缓解EM相关疼痛症状以寻求EM的潜在治疗策略。

建立大鼠子宫内膜异位症模型：成年雌性大鼠在无菌条件下预先腹腔内注射戊巴比妥钠(40mg/kg）。开腹后分离右侧子宫角，切下一厘米组织，放置在含有0.9%NaCl的培养皿中，纵向剖开。将子宫内膜与肌层分离，剪取3 mm×3mm的内膜组织植入右侧腓肠肌上。假手术组（Sham组）遵循相同的步骤，但缝合到腓肠肌上的植入物是3mm×3mm的腹膜脂肪。此外，研究中还设立未进行手术组（Naive组）进行对照比较。

   术后3d后，研究者使用电子压力测痛仪确认异位植入内膜组织部位（右侧腓肠肌）是否出现痛觉过敏。行为学测试显示，与Sham组、Naive组相比，内膜组织异位移植组（EM组）大鼠自术后第3天开始出现更强的压痛反应(图1a)。在术后第7天和第14天，子宫内膜异位模型大鼠的移植部位解剖显示出现囊性病变，而Sham组大鼠却未出现(图1b)。HE染色显示EM组异位内膜组织与周围肌肉黏连，成纤维细胞增生，呈现弥漫性充血(图1c)。结合EM的临床症状和病理表现，研究者确认成功构建子宫内膜异位症的大鼠模型，并发现HMGB1在异位内膜组织中表达上调（图1d）。

▲ 图1

    免疫荧光结果显示HMGB1在感觉神经元中表达，且HMGB1分布从细胞核向胞浆转移，呈现促炎反应状态。与Sham组（21.27%）相比，胞浆中的HMGB1在EM组大鼠背根神经节表达在术后7d(40.36%)和术后14d(45.19%)上调(图2a–c和图S1A)。在术后14d，研究者检测了DRGs中的表达HMGB1感觉神经元的不同亚群情况，其中HMGB1+神经元中39.86% 与降钙素基因相关肽(CGRP)共标、43.18%与非肽能等电蛋白B4(IB4)共标，30.21%与瞬时受体电位香草酸-1(TRPV1)共标(图2d-f和图S1b)。此外，相较于Sham组，EM组大鼠SDH中HMGB1表达显著上调 (图2g, h和图S1c)，且主要分布在SDH浅层。以上结果提示，EM在中枢和外周神经系统中均诱导HMGB1表达上调，并可能激活下游TLR4信号通路(图2i-k)。

▲ 图2

    在EM组术后7d时，研究者检测到DRG中TLR4蛋白表达上调达到峰值，而Sham组和Naive组并未出现该现象（图3a，b）。免疫荧光结果进一步表明，DRG中表达TLR4的神经元数量比例在EM组中增加(Sham 19.84%；EM 39.39%)，并且主要在直径较小DRG神经元中表达差异显著(图3c, d)。此外，研究者通过免疫荧光检测了EM组中TLR4+感觉神经元的亚群，表达上调的TLR4+神经元与以下标志物共标情况如下：IB4+ (18.90%~36.36%),CGRP+(23.72%~64.99%)和TRPV1+(32.12%~49.77%) (图4g)。

▲ 图3

▲ 图4

   研究者检测到在EM组中DRG中MyD88的蛋白表达水平在术后逐渐升高，并在术后14d至21d一直保持较高的表达水平(图5a, b)。免疫荧光显示MyD88定位于DRG中的感觉神经元。与Sham组相比，EM组大鼠背根神经节中表达MyD88蛋白的神经元比例增加(Sham 43.14%; EM 64.44%)，尤其是小径神经元(Sham 49.00%；EM 80.17%)(图5c, d)。此外，研究者通过免疫荧光检测了EM组中MyD88+感觉神经元的亚群情况(图6a-f)：MyD88+IB4+神经元(Sham 19.12%；EM 48.11%)、MyD88+CGRP+神经元(Sham 22.05%；EM 33.72%)和yD88+TRPV1+神经元(Sham 19.77%；EM 46.27%)，以上三类亚群均在EM组中表达上调（图6g）。综上，子宫内膜组织异位后，DRG感觉神经元中的TLR4-MyD88信号可能被激活。

▲ 图5

▲ 图6

   NF-κB是TLR4-MyD88信号通路的转录因子，可被磷酸化激活。EM组与Naive组、Sham组相比，DRG中磷酸化的NF-κB p65在术后3-21d蛋白表达水平逐渐升高(图7a, b)。免疫荧光结果也进一步予以证明(图7c-i)。研究者还比较了EM组和Sham组移植同侧（右侧）和对侧（左侧）DRG中HMGB1、TLR4、MyD88和p-NF-κB的蛋白表达。结果提示以上蛋白在移植同侧DRG中较对侧中表达上调(图7j-k)，表明EM诱导同侧DRG中TLR4/MyD88/NF-κB通路的激活。综上，EM通过激活DRG中的TLR4-MyD88信号通路，在子宫内膜组织异位部位引起疼痛。

▲ 图7

    已有研究表明，TLR4信号可引起脊髓背角(SDH)内胶质细胞的激活，这与多种类型疼痛发生有关。MyD88也被报道在星形胶质细胞和小胶质细胞中表达，并参与了神经病理性疼痛发生发展。在本研究中，术后第3d起EM组DRG中TLR4和MyD88表达持续上调。NF-κB p65磷酸化增强也表明EM组大鼠脊髓背角TLR4信号被激活(图8a, b)。GFAP是中枢神经系统内星形胶质细胞的标志物，而IBA1则被认为是小胶质细胞标志物。免疫荧光显示星形胶质细胞和小胶质细胞在移植同侧SDH中数量增加，表明两种胶质细胞被激活(图8c-f)。另外，在术后14d，EM组大鼠SDH中TLR4与GFAP和IBA1共定位，表明EM组中星形胶质细胞和小胶质细胞中的TLR4表达上调(图 8g, h)。

▲ 图8

    为了确认TLR4信号通路在EM疼痛发生中的作用，研究者使用了特异性TLR4拮抗剂(LPS-RS-Ultra, LRU)和MyD88同源二聚抑制肽(MIP),在术前3d到术前1d每日鞘内注射LRU(20μg/20μL)或MIP(500μM/20μl)。数据显示，LRU和MIP预给药均能减轻EM组大鼠在术后3d-9d发生的疼痛，而对Sham组大鼠没有影响(图9a, b)，这提示着TLR4信号通路参与了EM疼痛发生机制。此外，研究者在术后3d开始，每日鞘内给药，连续给药3天后发现，LRU和MIP给药均可以缓解EM引起的疼痛，且在术后7d-21的期间效果显著（图9c, d）。

▲ 图9

    为了进一步研究TLR4-MyD88信号通路在EM疼痛发生中的作用，研究者在检测了DRG感觉神经元中磷酸化NF-κB p65蛋白表达水平。结果显示，术后3d-5d使用LRU，显著降低了术后14d DRG中NF-κB p65的磷酸化水平。同样的，术后3d-5d使用MIP治疗，也降低了第14天NF-κB p65的磷酸化(图10a-d)。此外，在接受LRU和MIP的治疗后，星形胶质细胞和小胶质细胞的活化也减少(图11a-e，i-j)。

▲ 图10

▲ 图11

总 结

CONCLUSION

    在本研究中，研究者发现在脊髓背角和背根神经节中HMGB1-TLR4-MyD88信号通路可能参与子宫内膜异位相关疼痛的发生发展，并验证阻断以上信号通路是EM相关疼痛的潜在治疗方法。