MSI检测，选NGS还是PCR?
如果需要进行Lynch综合征筛查，或者寻求免疫治疗的实体瘤，也建议检测MSI状态。
我国每年新增微卫星高度不稳定（MSI-H）肿瘤患者约30万，随着MSI-H/dMMR检测的推荐地位不断提升，微卫星不稳定（MSI）已经成为预测免疫治疗疗效最重要的生物标志物之一。哪些患者应检测MSI呢？NCCN/CSCO指南推荐MSI检测的瘤种有：结直肠癌、胃癌、子宫内膜癌、小肠腺癌、胰腺癌、前列腺癌、食管癌或胃食管交界肿瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝胆肿瘤、乳腺癌等。此外，如果需要进行Lynch综合征筛查，或者寻求免疫治疗的实体瘤，也建议检测MSI状态。MSI检测对于判断预后、辅助诊断Lynch综合征、预测辅助化疗疗效、预测免疫治疗疗效有着巨大的临床意义。
肿瘤患者进行MSI检测，是选择NGS还是PCR？让我们先来看下两者方法学的比较（图1）。
图1、MSI状态检测方法学比较[1]
与传统的PCR毛细管电泳方法比较，基于NGS的MSI检测具有明显的临床应用优势：
一
NGS方法：MSI+多基因多靶点同时检测
PCR方法：仅单独检测MSI
1、
在肿瘤的临床诊疗中，NCCN/CSCO指南在推荐检测MSI的同时，也推荐进行TMB和驱动基因等与治疗相关的基因检测，为患者找到更多的靶向和免疫治疗的机会。NGS可以全面覆盖这些检测内容，同时满足临床需求，而PCR方法则不能。
2、
MSI-H在实体瘤中普遍占比较低，对于多数实体瘤患者，单独进行 MSI 检测的成本-效益比过低，而基于NGS的MSI检测可同时捕获多段基因组序列，利用其中已有（或额外增加）的微卫星位点，高效利用样本，并且提升检测的成本-效益比[1]。
3、
关于林奇综合征的筛查，NGS可以同时检测错配修复基因（MMR，包括MLH1, MSH2, MSH6和PMS2）或者EPCAM基因的胚系致病变异，可以直接诊断林奇综合征。而PCR方法仅能辅助诊断，可能存在漏诊，还需要其他信息或者基因检测结果来进行确诊。需要注意的是，以MMR蛋白/MSI检测作为林奇综合征的初筛手段，有可能漏诊部分患者。以结直肠癌为例，即使对所有结直肠癌患者进行MMR或者MSI普筛，也可能存在高达10%的漏诊率[2]。
二
NGS panel：可覆盖至上千个微卫星位点，有望增加非CRC样本检测敏感性[1]
PCR方法：5-7个位点
1、
2B3D是美国国家癌症研究所（NCI）于1998年最早推出的基于PCR方法检测MSI的5个位点，包含2 个单核苷酸重复位点( BAT-25 和 BAT-26) 以及 3 个双核苷酸重复位点( D2S123、D5S346 和 D17S250)。前期PCR-MSI研究表明，单核苷酸重复序列在PCR-MSI检测中敏感度更高[3]，而多核苷酸重复序列本身的多态性导致检测方法对配对正常样本具有依赖性。为了提高检测的敏感性和特异性，去掉了双核苷酸重复位点，2002年修订为Pentaplex panel，包含5个单核苷酸重复位点BAT-25、BAT-26、NR21、NR24 和 NR27。[4]
2、
基于WGS和WES的研究证明，不同标志位点可能表现为癌种特异性，也可具有跨癌种普遍性的特征，因此，NGS panel覆盖更多的微卫星位点，可以检测泛癌种的MSI状态。思路迪在2017年推出的NGS-MSI组织检测已经升级到100个MSI位点，极大地提高了检测的灵敏度。2019年又升级到500个MSI位点，综合考虑各种指标，再次提高了非结直肠癌样本检测的灵敏度。
三
NGS方法与PCR方法相比，无需提供正常组织为对照，对样本质量要求低，兼容性更好。
PCR方法检测MSI，需要提供肿瘤组织样本和正常对照样本的配对石蜡切片，并且肿瘤组织样本中肿瘤含量≥20%，而NGS只需要提供肿瘤组织样本，且肿瘤含量≥10%即可。对于肿瘤含量在10%-20%的患者，可以通过NGS检测扩大MSI检测的获益人群。同时，NGS可以接收石蜡切片/蜡块、新鲜手术组织、新鲜穿刺/胃肠镜等活检组织进行检测，兼容性更好，方便了广大肿瘤患者。
四
NGS方法可以通过外周血样本检测MSI状态，而传统的PCR方法无能为力
临床上，有很多肿瘤组织取样困难或不足的晚期实体瘤患者，只要抽取8-10ml的静脉血，NGS可以提供bMSI（血液MSI）的检测结果。
五
NGS可以通过bMSI与bTMB联合筛选更多免疫治疗获益患者[5]
虽然目前仅MSI-H患者被证实可以从免疫治疗中得到更大获益，但从临床实验和临床实践的反馈来看，部分MSS患者仍可能从免疫治疗中获益。思路迪研究证实，在胃肠肿瘤中，bMSI与bTMB均能预测免疫治疗疗效，只要携带bMSI和bTMB这两个免疫疗效预测标志物之一，即可获得较bMSS且bTMB-L患者更长的生存。[5]
六
NGS是自动化分析，可以避免PCR人为读图的误差
面对海量的下机数据，思路迪NGS检测可以自动化的进行生信分析并生成报告，避免人为读图带来误差（图2）。而PCR检测MSI状态通过人工判读正常对照样本中的有效峰和肿瘤样本中的位移峰，确定断点是否稳定，进行微卫星状态的判定，可能出现主观判断的误差。（图3）。
图2、思路迪NGS方法检测的MSI结果（MSI-H）
图3、使用PCR方法检测的MSI结果（MSI-H）
综上所述，通过比较方法学和临床实际应用场景，基于NGS的MSI检测具有明显的临床应用优势。
当然，NGS-MSI检测也存在一定的挑战：
1、
识别有良好区分性的微卫星位点需要优良的算法和大量样本验证；
2、
重复序列捕获和测序的难度要比一般序列更高，且极易受到实验环节各种因素的影响，故在建库流程、测序参数调校和生物信息学分析等方面都更加复杂精细[1]。
为解决这些问题，思路迪首先在探针设计、建库流程、测序参数调整和生物信息学分析方面都有针对性升级；其次，通过科学统计建模，以构建最优的评分模型，最大程度地区分MSI-H和MSS状态；最后，相比其它检测方法，经过验证，3D-MSI算法在低肿瘤细胞含量的样本中，仍然可以稳定地检测检出MSI状态。思路迪拥有CLIA和CAP双C认证、技术临床双重验证、以及MSI的专利技术，为患者提供稳定、可靠的MSI检测产品。
|来源：思路迪
参考文献
[1] 中国临床肿瘤学会结直肠癌专家委员会, 结直肠癌及其他相关实体瘤微卫星不稳定性检测中国专家共识[J]. 2019, 34(5): 381-389.
[2] Palomaki GE，McClain MR，Melillo S，et al. EGAPP supplementary evidence review: DNA testing strategies aimed at reducing morbidity and mortality from Lynch syndrome[J]. Genet Med，2009，11( 1) : 42 - 65.
[3] Zhu LZ，Huang YQ，Fang XF，et al. A novel and relia- ble method to detect microsatellite instability in colorec- tal cancer by next-generation sequencing[J]. J Mol Di- agn，2018，20( 2) : 225 - 231.
[4] Suraweera N，Duval A，Reperant M，et al. Evaluation of tumor microsatellite instability using five quasimono- morphic mononucleotide repeats and pentaplex PCR[J]. Gastroenterology，2002，123( 6) : 1804 - 1811.
[5] Plasma-based microsatellite instability detection strategy to guide immune checkpoint blockade treatment[J]. J Immunother Cancer, 2020, 8(2):e001297.
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