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8分+的m6A甲基化分析思路

2021

06/17

作图丫

A-

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m6A甲基化修饰是哺乳动物蛋白质编码mRNA中最普遍的RNA修饰，是一种具有多种重要生物功能的可逆修饰。m6A的形成和功能由甲基转移酶（writers）、去甲基化酶（erasers）和结合蛋白(readers）作为关键因素来调节。

背景介绍

今天，小编给大家带来了在Gastrointestinal Cancer中m6A调节蛋白与经典自噬通路 PI3K/Akt/mTOR分析的相关思路，这篇文章于2020年发表在《Theranostics》期刊上，影响因子8.58，题目为:m6A RNA modification modulates PI3K/Akt/mTOR signal pathway in Gastrointestinal Cancer.

数据介绍

TCGA: 1920/10037(19.1%)个胃肠道癌（GI）样本及正常样本，共有9,628个样本用于通路改变分析，从cBioportal收集基因表达数据和蛋白富集数据

GEO： GSE48037，GSE46705，GSE55572，GSE76367高通量测序数据

1,000 Genome Project database： Genetic variant files variant call format (VCF)

结果解析

m6A Writers, Erasers和Readers在GI Cancer中的分布情况分析

首先，使用TCGA数据库研究了 m6A writers, erasers和readers 包括METTL3、METTL14、WTAP、FTO、ALKBH5、YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3的分布情况。比较了1782例癌症样本和148例正常对照样本中m6A相关基因的表达模式，热图分析显示，GI cancer中m6A调节蛋白的表达明显较高（Fig.1B）。

比较GI cancer五种亚型（食管癌、胃直肠癌、结肠癌、结肠癌和胰腺癌）的癌症和正常样本(Fig.1C)表明，除了胰腺癌，与正常对照组相比，胃肠道癌中m6A调节蛋白表达水平大多上调。

使用cBioPortal和 GISTIC2.0 分析了m6A调节蛋白的遗传学改变，约11.9%的临床样本（204/1710）发生了m6A调节蛋白基因扩增，近4.6%的样本（79/1710）有基因组突变。一些reader蛋白、YTHDF1、YTHDF3和HNRNPA2B1显示出相对较高的拷贝数扩增频率。(Fig.1D)

Fig.1

m6A调节蛋白的改变对GI cancer患者生存的影响

使用TCGA数据库对五种亚型的m6A调节蛋白进行了OS分析。

Kaplan–Meier分析显示，m 6A调节蛋白的差异表达与OS显著相关。特别是，METTL3的高表达与食管癌和结直肠癌的生存率显著相关（p<0.05）。相比之下，METTL3的低表达与胃癌、肝癌和胰腺癌的低生存率显著相关。ALKBH5的高表达与结直肠癌的低生存率显著相关，而与胃癌和胰腺癌的高生存率相关。这些结果表明m6A调节蛋白可能对胃肠道癌生存率有重要影响。（Fig.2）

Fig.2

胃癌m6A下调相关信号通路的鉴定

由于m6A修饰经常参与mRNA代谢和翻译，以影响蛋白质表达水平，作者想找到与m6A调节蛋白相关的蛋白质。

对GI蛋白（包括 parent and phosphorylated proteins ）表达与m6A 调控基因变化(突变、拷贝数变化、mRNA表达变化)进行相关分析。具有显著变化的主要蛋白质（p<0.05）见Fig.3A。

利用KEGG数据库分析了27个人类癌症中的上述蛋白质，共富集到41条不同的路径（Fig.3B）。

这些蛋白与几种关键途径相关，包括PI3K/Akt，mTOR、FoxO、prolactin、estrogen、 insulin和ErbB信号途径，这些途径普遍存在于27种主要人类癌症中（Fig.3C）。重要的是，与 GI cancer 中m6A修饰呈正相关的五种途径（PI3K/Akt、mTOR、FoxO、 MA PK 和p53），同时也存在于 K EGG癌通路中（ Fig. 3D）。

Fig.3

五种癌症信号通路的失调及与m6A members的关联

使用cBioportal分析了27种TCGA癌症类型的体细胞变异和DNA拷贝数变化，如Fig.4A所示，PI3K/Akt通路在27种人类癌症类型中的改变频率最高（75%）。

进一步的热图分析表明，这5条通路中的主要基因在27种癌症中存在高频变化（Fig.4B、C）。Fig.4D中的路径图显示了胃肠道癌中最常改变的基因直接或间接受m6A的影响的方式，包括改变的频率和类型、细胞功能以及与通路中其他基因的相互作用类型。

作者还进行了m6A site预测，通过SRAMP的两种随机森林预测模式进行计算，以提高识别阈值，筛选到了一些PI3K/Akt/MTOR通路，以及FoxO、MAPK和P53通路的基因。（Fig.4E）

这些结果表明，m6A在调节癌症通路如PI3K/Akt/mTOR通路中发挥着重要作用。

Fig.4

m6A失调对胃肠道肿瘤PI3K/Akt/mTOR通路的影响

通过分析GEO数据库中METTL3 KD数据集，发现METTL3的敲低会导致PI3K/AKT/MAKR信号通路蛋白AKT1、AKT2、PTEN、PIK3CA和BCL2表达相对升高（ Fig.5A ）。 Hela和A549细胞中AKT1、PTEN和PIK3CA的基因reads密度见（Fig.5B、E、H），

为了研究PI3K/Akt通路与关键基因位点变异异常相关的失调，作者分析了 1000 Genomes Project中(AMR、EAS和EUR中)的SNPs。然后使用m6A SNPs来检测在这些位点周围被突变所改变的m6A位点。Fig.5C为AKT1突变序列的DRACH基序。作者识别了AKT1中的SNPs(rs185142105、rs 189600949、rs5027535、rs113244357、rs192598160和rs111541557)突变导致m6A的修饰的改变(Fig.5D)。

在PIK3CA中的rs201800261,rs541500284,rs987628，PTEN的rs554012318和rs186567851 以及AKT1S1的rs546549861也发现了类似的现象 ( Fig.5F-J ) 。

Fig.5

胃肠道患者m6A下调对PI3K/Akt/mTOR通路影响的体外研究

为了定位全转录组水平上的m6A位点，将m6A-seq应用于从人类胃癌细胞系(TMK1)中纯化的RNA，进行大规模平行测序（Fig.6A）。在mTOR、AKT1、PIK3CA和PTEN中都发现存在m6A甲基化的序列特征（Fig.6B）。

在mTOR和PIK3CA中，3‘UTR和相邻区间都存在m6A peaks富集，PTEN存在5‘UTR区域附近的m6A peaks富集（Fig.6C）。AKT1 m6A修饰主要是CDS区域。此外，在这四个基因中，平均结合位置分析表明，在转录终止位点中的m6A结合活性 (TTS) 略高一些（Fig.6D）。

如Fig.6E所示，MTOR、AKT1、PIK3CA和PTEN的m6A修饰峰在CPG岛中心明显富集。