单抗申报IND之病毒安全性评价要点

本文调研了2018-2020 年，申请人针对创新单抗药物申报临床阶段的一般性技术问题，发现申请人聚焦的问题包括生产终末细胞和/或细胞收获液检定以及病毒去除或灭活验证。

同时，审评中也发现由于申请人对国内外技术指南阶段性要求理解的差异，导致申报资料也存在一定差异。

为确保生产的可持续性以及产品的一致性，重组单抗药物生产过程中一般需要建立细胞库，包括原始细胞库（PCB）、主细胞库（MCB）和工作细胞库（WCB）。

对于已建立的细胞库，应参照《中华人民共和国药典》通则《生物制品生产检定用动物细胞基质的制备及质量控制》进行检测，检测项目包括鉴别、微生物污染检测、内外源病毒因子检测、逆转录病毒检测及特异性病毒检测等。

虽然在细胞库阶段对MCB 和WCB 进行了内外源病毒因子检测，但有些内源性病毒可能在MCB 和WCB 阶段未被检出，或者在生产过程中引入偶然的病毒因子污染，因而对生产终末细胞和/或细胞收获液中的病毒因子进行检测和控制非常重要。

我国目前虽然在《中华人民共和国药典》、《生物组织提取制品和真核细胞表达制品的病毒安全性评价技术审评一般原则》以及《重组制品生产用哺乳动物细胞质量控制技术评价的一般原则》中分别提及了对EOPC 或UPB 检定的要求，但以上指南主要是针对上市的要求。

国内企业早期申报临床试验阶段对于生产过程中病毒检测主要参照了《中华人民共和国药典》相关要求，对临床申报注册工艺下的EOPC 进行了一次全面检定，而并未考虑对工艺过程中UPB 进行病毒检测。

FDA 参照《Points to Consider in the Manufacture and Testing ofMonoclonal Antibody Products for Human Use》（人用单克隆抗体产品的生产和检测的相关考虑，即PCT1997）进行UPB 的检定；

目前对于创新药申报临床试验阶段的UPB 检测主要参考该指南，该技术指南对UPB、原液和最终产品的检定提出了要求，明确说明对于每个批次收获液进行生物负荷、支原体、外源病毒因子、特定外源病毒和逆转录病毒的控制（逆转录病毒颗粒定量）.

EMA 在2008 年发布了《Guidelineon Virus Safety Evaluation of Biotechnological Investigational Products》（生物技术研究产品病毒安全性评价技术指南，即EMA2008），主要针对生物技术产品在申报 IND时病毒安全性评价的指南，指南中对于EOPC 和/或UPB 检定的要求给予了明确规定。

EMA2008 指南强调，每一批用于临床试验用样品的UPB 需参照ICH Q5A 进行检测，待测样品应包括细胞，在适用的情况下测试应包括体外和基于聚合酶链反应（PCR）的外源病毒因子试验和逆转录病毒颗粒评估，逆转录病毒或逆转录病毒颗粒的定量仅需针对特定开发阶段的前3 批UPB 进行（或更少，如制备少于3 批UPB）。

对于源自中国仓鼠卵巢细胞系（Chinese hamster ovary cell, CHO），无需进一步测试；对于基于小鼠骨髓瘤细胞（mouse myeloma cell）的NS0 或Sp2/0 细胞系，应进行一次传染性逆转录病毒检测；但如果细胞培养发生重大变化（如生产规模），应重新进行传染性逆转录病毒检测。

对于基于任何其他细胞系的产品，应进行一次传染性逆转录病毒测试和体内测试，但如果生产发生重大变化（如生产规模），则应重复进行传染性逆转录病毒测试。

如果细胞产品采用的细胞系对鼠细小病毒（mouse minutevirus, MMV）易感，则应考虑进行MMV 测试。

同时指南还强调如果UPB 进行了上述检测，则无需在对体外限传代次细胞进行检测，这里的体外限传代次细胞即为EOPC。

作者认为，申报IND 阶段的EOPC 一般来自于申报临床注册工艺下的细胞进行连续几次体外传代后冻存得到的细胞，属于一次全面检定，后续临床试验用样品的UPB缺少对病毒污染的检查。UPB 作为整个生产工艺中病毒污染最易检出的工序，相比仅进行一次EOPC 检定对于病毒污染的控制策略更为有效，主要基于以下考虑：

①确保每个用于临床试验用样品在收获液阶段均进行了病毒污染检测；

②未对UPB 进行操作和处理，可排除额外操作可能引起的病毒滴度降低或病毒活性被破坏的风险；

③相比EOPC 一次全面检定，可更加严格地控制细胞收获液中可能引入的病毒污染的风险，可最大程度确保最终用于人体临床试验用样品的安全性。

我国目前在申报IND 阶段开展病毒去除或灭活验证主要参考了《血液制品去除/灭活病毒技术方法及验证指导原则》和《生物组织提取和真核细胞表达制品的病毒安全性评价技术审评的一般原则》相关要求。

国内技术指南对于选择指示病毒类型规定较为详细，明确至少应包括单链和双链的核糖核酸（RNA）及脱氧核糖核酸（DNA）、脂包膜和非脂包膜、强和弱抵抗力、大和小颗粒等病毒；

从工艺步骤选择上，该技术指南规定“对于真核细胞表达制品应至少包含一个有效工艺步骤，并能够有效去除和/或灭活非脂包膜病毒；

从病毒去除或灭活验证有效性判定上，国内技术指南一般认为病毒感染性滴度减少≥4 lg的处理步骤为有效的病毒去除或灭活工艺步骤，如果去除效果仅够1 lg 甚至低于1 lg，通常可忽略不计，不计入工艺的总去除指数内[7]；

从验证批次方面，参照《血液制品去除灭活病毒技术方法及验证指导》要求，一般需提供连续3 批病毒灭活前的中间品进行病毒灭活方法效果验证。

FDA 主要参考PCT1997 及《美国药典》（United States Pharmacopoeia, USP）《Design, Evaluation, and Characterization of Viral Clearance ProceduresIntroduction》（简称USP <1050.1>）在申报IND阶段采用简化的病毒去除/灭活验证；

FDA 早期发布的技术指南在指示病毒选择上未明确具体的要求，总体原则是建议选择一种或多种病毒，应包括已知或怀疑污染细胞系病毒，也可采用模型病毒（与污染病毒性质类似、可培养至高滴度且易于检测分析）；

2013 年USP <1050>指出，用于病毒清除率评估和表征研究的病毒，应采用性质与可能污染产品相似的病毒以及具有较强的物理化学耐受特性的代表性病毒，根据评估和表征研究的目的说明病毒选择的合理性；

2016 年USP <1050.1> 中指出，通常在产品开发的早期临床阶段使用至少两种病毒，一种是包膜的 [通常是逆转录病毒，如鼠白血病病毒（murine leukemia virus,MuLv）]，另一种是无包膜的（最好是细小病毒，如MMV），用于过程评估和过程特性研究的模型病毒应与可能污染产品的病毒性质相似，但是还应检测具有较强的物理化学耐受特性的其他病毒，后者对于证明纯化过程能够去除/灭活多种病毒至关重要；

从验证工艺步骤方面，FDA 相关技术指南均指出应采用不同作用机制的至少两个正交步骤，且在USP <1050.1> 中指出，在产品开发的早期临床阶段，每个病毒至少应评估两个正交的病毒去除或灭活步骤，有效步骤的可重复性应通过执行两个独立的试验来评估，或者过程开发历史（或经验）应能支持可重复性；

从病毒去除或灭活验证有效性判定上，FDA 相关技术指南指出，通常认为单个病毒清除步骤有效需证明病毒滴度降低4 lg 或更多，相反证明1~3 lg的清除步骤被认为是辅助步骤，但考虑到测定方法的内在变异性，减少1 lg 值不计入总去除指数内。

EMA 发布的有关于病毒安全性和病毒清除验证相关的技术指南中对于指示病毒选择、验证步骤选择、去除效果有效性差异等方面的总体原则与FDA 基本一致。

主要差异是EMA 强调了病毒安全性评估还应包括每剂量中病毒颗粒量估算，同时应结合临床试验的总体风险进行评估，如适应症、剂量、给药频率、人群暴露量、研究持续时间和患者免疫状态等。

ICH Q5A 主要是针对上市产品的病毒安全性评估，这个阶段需要开展全面的、完整的工艺去除或灭活验证研究，并评价整体工艺对病毒污染控制的可行性，对于病毒种类的选择、验证步骤的要求以及最终逆转录病毒颗粒数量的安全性评估均进行了全面的阐述和说明。

我国监管指南与国际监管指南在病毒去除或灭活验证技术要求的理念上基本一致，但我国病毒安全性相关监管指南主要针对上市要求，申报临床阶段如何在控制病毒安全性风险的前提下进行简化研究，仍需监管机构和工业界不断进行探讨。

国外申请人对于病毒去除/验证的策略相比国内申请人虽然减少了验证病毒的种类以及验证批次，但在验证步骤方面考察了3 种不同作用机制的工艺步骤，且每个步骤基本考察了对相关或特异性模型病毒以及理化抗性较强、易污染CHO 细胞且较难灭活的相关模型病毒的去除或灭活效果，在一定程度上也证明了工艺步骤去除或灭活其他病毒的能力。

虽然在验证批次方面未开展3 批中间品的病毒去除或灭活验证，但采用一个临床工艺代表性批次重复两次试验的验证策略，证明去除/灭活效果的稳健性和重复性更加合理，且一个批次重复两次试验的做法与目前ICH Q5A 的要求也一致。