如何用少量样本进行肿瘤进化和化疗耐药分子特征分析

今天给大家分享的这篇文献研究的肿瘤也比较特殊，为卵黄囊瘤（yolk sac tumors，YST）。此篇文章是今年6月份Nat Communication刚刚见刊，文章的题目是“Analysis of the genomic landscape of yolk sac tumors reveals mechanisms of evolution and chemoresistance”，也就是卵黄囊肿瘤基因组景观分析揭示进化和化学抗性机制。简单来说，本篇研究对卵黄囊肿瘤的RNA测序和DNA测序数据进行分析，从分子层面探索肿瘤进化和肿瘤化疗耐药的临床问题。

1 背景介绍

疾病基本情况： 基本情况参考百度百科。卵巢卵黄囊瘤又称内胚瘤，是一种来源于原始生殖细胞的具有胚体外卵黄囊分化特点的高度恶性生殖细胞肿瘤，约占卵巢恶性肿瘤的4%～ 7%，好发于青少年及年轻妇女，预后差。

治疗与预后： YST 患者的标准治疗是手术+基于顺铂的化疗。YST与其他卵巢生殖细胞肿瘤相比，YST患者的预后较差。YST 复发的治疗选择非常有限，即使在细胞减灭手术和挽救性化疗后，仍有超过 50% 的复发患者死于疾病。化疗耐药是其中主要的原因。因此，阐明与 YST 对化疗耐药相关的分子机制具有重要的临床意义。

已有的研究：  卵巢生殖细胞肿瘤和睾丸生殖细胞肿瘤均源自原始生殖细胞，并且具有相似的发病年龄、组织学亚型和治疗反应。目前在分子水平上对 YSTs 的了解非常有限，主要来源于睾丸生殖细胞肿瘤 (TGCTs)。

TGCT 的特点是体细胞突变率低、体细胞拷贝数改变 (SCNA) 频率高。KIT 和 KRAS 是两个最常发生突变的基因。与几乎所有其他实体瘤不同的是，TP53 突变在 TGCT 中很少见，完整的 p53 被认为是化学敏感性的重要机制，因为它会诱导对 DNA 损伤的强烈凋亡反应。然而，YSTs 具有一些不同于其他卵巢生殖细胞肿瘤 和 TGCTs 的特定分子特征。例如，与无性细胞瘤和 GCT 相比，与 WNT/β-catenin和 TGF-β/BMP 通路相关的基因在YST 中过表达。

尽管最近进行了癌症基因组描述工作，但 YST 是分子水平上表征不佳的癌症类型之一。这种疾病的基因组景观、进化模式和化学抗性相关机制在很大程度上是未知的，这导致开发诊断、预后和治疗策略困难。

此研究的工作： 鉴于前面提出来的问题，故在此研究中，研究者对大量临床 YST 样本进行全外显子组和 RNA 测序，以系统地识别与该疾病化学抗性相关的分子驱动因素和关键特征。

2 结果部分

2.1 研究设计总览和YSTs的肿瘤突变负荷

图1A展示病人的纳入与分组：

病人纳入： 纳入30 名 YST 患者，并获取了肿瘤和血液样本。对肿瘤和血液样本进行了全外显子组测序，其中包括 26 个原发和 15 个复发的 YST 样本（4 名患者没有原发样本，7 名患者同时有原发和复发样本，其中 1 名有多个复发样本）。

病人分组： 根据初始治疗后六个月内是否复发将 30 名招募的患者分为化疗敏感组（n = 20）和化疗耐药组（n = 10）。

图1b展示病人分组的合理性：

比较化疗敏感组与化疗耐药组中患者的AFP水平，结果是初始治疗 6 个月后，化疗耐药组的 AFP 水平显着高于敏感组（t 检验，p = 3.2 × 10-4），结果证实治疗效果分组有意义。

在本研究中，研究者采用MC3识别测序数据中的单核苷酸变异和小插入缺失，接着便对识别到的突变进行汇总和分析，探索这些指标可能与临床特征的相关性。

• 图1C：与其他癌症类型相比，YSTs 表现出中等水平的肿瘤突变负荷（TMB），显着低于卵巢癌（OV），但显着高于TGCT 或其亚型（Wilcoxon 秩和检验）。
• 图 1D：TMB 水平与诊断时的年龄呈显着正相关（Spearman 秩检验，p = 10-3），大致反映了随时间推移的突变积累效应。     补充图 1还探讨了TMB 与化疗反应的相关性，发现化疗敏感组和化疗耐药组之间没有显着差异。
• 图 1E：与匹配的原发肿瘤相比，复发肿瘤具有更高的 TMB（配对 Wilcoxon 秩和检验，p = 5 × 10−3），这可能部分是由于化疗的暴露。
• 图 1F：使用 MANTIS方法计算 26 个原发 YST 中微卫星不稳定性（MSI）分数。发现耐药组的 MSI 分数显着高于敏感组（Wilcoxon 秩和检验，p = 0.03）。由于 MSI 高已被确定为结肠癌化疗耐药的生物标志物，结果表明MSI 状态也可作为 YST 患者化疗耐药的预测标志物。

2.2 突变特征展示

肿瘤的突变特征提供了关于在癌症基因组上突变过程的宝贵信息。故接下来描述肿瘤中的突变特征。

图 2A：展示所有原发肿瘤样本中六个碱基取代的突变谱，并将其与 TGCT 和 OV 的突变谱进行比较，发现 YSTs 表现出较少的 C > A/G > T突变，但更多的 T > C/A > G 突变。 

图 2B：使用 SignatureAnalyzer（一种广泛使用的基于贝叶斯非负矩阵分解算法的突变特征分析工具）分解突变谱，以进一步系统研究 YST 的突变特征，最终确定了三个特征：W1、W2 和 W3。接着进一步解析每个特征对应的COSMIC特征(见补充图)。

前面的分析发现了这些突变特征，那么就探索他们在肿瘤分组（敏感原发肿瘤、耐药原发肿瘤和复发肿瘤）中的意义。结果表明 YST 突变特征也是肿瘤化疗反应预测的信息。

特征 W1 在复发肿瘤中的贡献远高于原发肿瘤（Kruskal-Wallis 检验，p = 1.4 × 10-5，FDR = 4.2 × 10-5），并且在原发肿瘤中，其在敏感肿瘤中的贡献显着高于抗性肿瘤（Wilcoxon 秩和检验，p = 0.035，FDR = 0.1）; 特征 W2 显示出从敏感原发肿瘤到耐药原发肿瘤再到复发肿瘤的明显下降趋势（Kruskal-Wallis 检验，p = 2.1 × 10-3；FDR = 3.2 × 10-3）。此外，用同样的方法探索了W1、W2和W3对应的COSMIC特征在肿瘤分组中的贡献（见附图）。

2.3 显著突变和体细胞拷贝数改变的基因

使用 MuSiC2根据观察到的相对于背景期望的突变频率来识别显着突变的基因 (SMG)，从而探究肿瘤中可能的突变驱动基因。这里纳入的样本是：性腺发育正常的患者的 24 个原发 YST 样本（来自性腺发育不全患者的两个原发肿瘤样本被排除在该分析之外并单独分析）。

显著高频突变基因展示：

图 3A: 展示显著突变基因的突变全景图，在前16个显著突变基因中，包括KRAS 和 KIT、ZNF708、FRG1 和 NPAS1。这些基因在先前的研究中都有发现。 

图 3B：因为癌症基因 TP53 在任何这些 YST 样本中都没有发生突变，故将TP53的突变频率与其他肿瘤中的突变频率进行比较。形成鲜明对比的是，卵巢癌中TP53的突变频率在所有肿瘤中排名第二。

除了探讨突变驱动事件，拷贝数变异驱动事件也值得探究。

图 3C：使用 CNVkit 基于 24 个原发肿瘤和正常样本对进行 SCNA 分割，然后使用 GISTIC2 识别肿瘤中重要的 SCNA 峰。总共检测到18个扩增峰和15个缺失峰（FDR = 10-3）。 

图 3D：对SCNV峰进行细化。关注一组先前研究比较明确的的SCNA驱动基因， ARID1A 和 PARK2 是最常缺失的基因，而 ZNF217、CDKN1B 和 KRAS 是最常见扩增基因。除了正文图中的比较外，因为纳入的样本还包括具有前后配对的原发和复发的肿瘤样本，故比较原发和复发肿瘤样本中显著突变基因的突变情况，和SCNV 基因的扩增和缺失情况。

2.4 2个性腺发育不全 YST 患者的关键驱动事件和克隆进化

2名YST患者（P02和P03）诊断为XY单纯性性腺发育不全，在诊断时具有发育不良的性腺和恶性 YST（诊断年龄：P02, 33；P03, 18）。

图 4A、D：基于 WES 数据，有大量读数映射到染色体 Y 连锁男性特异性性别决定基因 SRY，证实了这两位患者有男性样染色体结构。 

图 4B、E: 这两名患者的基因突变情况，这两名患者的肿瘤在 KRAS 和 TP53 中都存在双突变（P02、TP53 p.C176Y 和 p.G262D、KRAS p.P34L，图 4B；P03、TP53 p.I225T 和 KRAS p.Q61R，图 4E）。是否KRAS和TP53双突变是性腺发育不全 YST 患者所特有的突变呢？研究者基于9125名TCGA患者的背景双突变频率对其进行统计检验，发现双突变的 TP53 和 KRAS 基因往往在性腺发育不全的 YST 患者中富集（Fisher 精确检验，p = 5.3 × 10−4）。 

同样，应该患者具有原发和复发时的肿瘤样本数据，故比较原发和复发时肿瘤中的基因突变情况（与原发肿瘤相比，这些基因的突变等位基因频率在复发肿瘤中较低）。

以上这些结果提供了对生殖系统异常发育的癌症的分子见解，并表明经典癌症驱动因素和性别特异性基因异常的协调可能在这个特殊患者组的肿瘤进化中发挥重要作用（图 4C，F）。

2.5 1个具有多个转移样本YST患者的肿瘤进化轨迹

因为在该研究中有1个患者P07，同时具有1个原发肿瘤样本，和3个不同部位转移的肿瘤样本。这为肿瘤转移进程的进化轨迹研究提供了基础。

图 5A：患者 P07，他有一个原发（P07-P）和三个复发肿瘤样本（P07-R1、P07-R2 和 P07-R3）。在该患者中，第一次手术后 9 个月检测到横结肠 (P07-R1) 的转移部位，7 个月后，发现了另外两个转移部位：一个在脾脏 (P07-R2)，一个在盆腔 (P07-R3)。 

图 5B： 汇总4个肿瘤样本中的突变情况。对突变重叠的分析表明，四个肿瘤样本中只共享两个突变（一个是错义，另一个是同义）。 

图 5C： 通过突变数据的进化树分析，表明晚期转移样本（P07-R2 和 P07-R3）来自原发肿瘤（P07-P），而早期转移样本（P07- R1) 显示出较早的与共同祖先的分裂。 

图 5D：通过 LOH 分析进一步证实了推断的进化关系，显示除 P07-R1 之外的所有肿瘤都共享全基因组 LOH 模式。

两个独立的系统发育分析，一致表明晚期转移样本（P07-R2 和 P07-R3）来自原发肿瘤（P07-P），而早期转移样本（P07- R1) 显示出较早的与共同祖先的分裂。

除了这种情况，来自其他几名患者的肿瘤没有明显的驱动事件（例如，P04 和 P23，见补充图 3A 和 B），暗示 YST 中存在分支进化模型。

这些结果表明，YST 进化模式可能比传统的原发→早期转移→晚期转移的线性进展视图更复杂。

2.6 OVOL2 过表达在化疗抵抗中的作用

前面探究了DNA突变数据与YST分组的关系，以及肿瘤进化的关系等等。接着着眼于RNA测序数据，探究基因表达与化疗耐药的相关机制。用到的数据：12 个 YST 样本（3个敏感的原发性肿瘤和9个复发肿瘤）生成 RNA-seq 数据。

图 6A：通过比较敏感和复发样本之间的基因表达谱，确定了 153 个显着差异表达的基因（倍数变化 >2 和 FDR <0.1；上调：136；下调：17）。

图 6B：差异基因通路富集分析。这些差异基因不仅富含 KRAS 信号，还富含胰腺 β 细胞和胆汁酸代谢。

图 6C-E：使用癌细胞系的药物敏感性数据将这些差异基因的表达水平与对顺铂（YST 患者的化疗标准）的抗性相关联，进一步确定化疗抵抗的潜在分子。图6D和图6E用到的就是癌细胞系数据量中的药敏数据和测序数据。OVOL2是最佳候选者。该基因在复发肿瘤中的表达水平显着高于敏感肿瘤，并且 OVOL2 的高表达与不同谱系癌细胞系的顺铂耐药性相关（Wilcoxon 秩和检验，p = 4.8 × 10-9，图 6D），特别是在卵巢癌细胞系中（Wilcoxon 秩和检验，p = 6.7 × 10-3，图 6E）。

这些结果表明OVOL2的过表达可能与YSTs的耐药机制有关。

2.7 湿试验验证敲低OVOL2表达，通过增强细胞凋亡使NOY1细胞对顺铂敏感

生信分析结合湿试验是本文的一大亮点，前面的分析发现OVOL2过表达与肿瘤化疗耐药相关。后续便用湿试验验证的方法去证实，是否OVOL2表达与化疗耐药相关，以及其中可能的机制是什么。

湿试验中用到的细胞株：卵巢 YST 细胞系（NOY1）和正常人卵巢表面上皮细胞系（HOSEpiC）。结果如下：

图 7A: 卵巢 YST 细胞系（NOY1）显示出比正常人卵巢表面上皮细胞系（HOSEpiC）更高的 OVOL2 表达。

图 7B-D: 敲低目的基因表达，观察结果。使用两个独立的小干扰 RNA（siRNA）使  NOY1细胞株中的OVOL2 表达降低。并发现在 NOY1 中，OVOL2 的敲低剂量和时间依赖性地降低了顺铂存在下的细胞活力。

图 7E-F：流式结果证明，顺铂处理后，敲低OVOL2 表达使 NOY1 对细胞凋亡增加。

图 7G-H：WB实验验证与凋亡相关的蛋白表达。敲低OVOL2 表达样本有更多的cleaved-caspase-3。

以上实验数据表明，OVOL2 敲低通过增强细胞凋亡使 NOY1 细胞对顺铂敏感。

3 讨论部分

本篇研究纳入30 名 YST 患者，并获取了肿瘤和血液样本进行测序。利用WES数据，本研究描述了YST患者中高频突变的基因，并将基因突变频率与其他类型肿瘤进行比较。同时也探索了突变特征、显著突变基因和显著拷贝数变异等等。

1. 本文的特色在于有特殊的疾病类型和前后配对患者的测序数据。 ①利用原发和耐药前后配对患者样本数据探究两种状态下的基因组学差异。②利用2个性腺发育不良患者样本测序数据，探究性腺发育不良合并YST 患者特殊的基因突变谱。③利用1个患者的原发肿瘤样本和多个转移样本，探究了肿瘤进化的可能进程。但是，这里用到的样本少，需要更多的数据支持结论。

2. 本研究的另外一个特色在于湿试验结合干试验。 基于RNA测序数据发现与化疗耐药相关的基因。结合数据库筛选与耐药相关的最可能基因，并进行湿试验部分验证。

参考文献：Zong X, Zhang Y, Peng X, Cao D, Yu M, Wang J, Li H, Guo X, Liang H, Yang J. Analysis of the genomic landscape of yolk sac tumors reveals mechanisms of evolution and chemoresistance. Nat Commun. 2021 Jun 11;12(1):3579. doi: 10.1038/s41467-021-23681-0. PMID: 34117242.

编辑: 吕琼

校审：罗鹏