编译：微科盟花城，编辑：微科盟木木夕、江舜尧。
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导读
由于畜牧业和医学领域抗生素滥用引起的抗生素耐药性，尤其是多重耐药菌的出现，对人类的健康构成严重威胁，因此迫切需要寻找不产生耐药性和残留的新型抗生素替代品。抗菌肽（AMPs）作为一种天然来源的生物材料，由于其独特的病原菌生物膜破裂机制，近年来成为抗菌制剂，特别是饲用抗生素替代品的热门候选。然而，天然存在的AMPs具有生物活性弱、毒性大、稳定性不成熟等一系列问题，严重限制和阻碍了其转化应用。随着分子设计和优化策略的进步，以及快速发展的纳米技术，在改善AMPs的生物和理化性质方面展现出巨大的潜力，使得AMPs的转化应用和产业化成为可能。在此，本文首先综述了AMPs的设计和优化策略的进展，为开发肽基抗菌纳米材料奠定理论基础，并提供更高效和安全的抗生素替代品。然后，本文总结了肽基抗菌纳米材料的构建策略和生物学效应。最后介绍了抗菌肽在畜牧和生物医学领域的应用，并提出该领域当前面临的挑战和未来展望。
原名：Design, optimization,and nanotechnology of antimicrobial peptides: From exploration to applications
译名：抗菌肽的设计、优化和纳米技术：从探索到应用
期刊：Nano Today
IF：20.722
发表时间：2021.07.05
通讯作者：马曦
通讯作者单位：中国农业大学动物科学技术学院
前言
1.4 AMPs两亲性的调节
2.4.1 特异性靶向抗菌肽（STAMPs）的设计 2.4.3 pH响应AMPs的设计
3.2.2 多价AMPs的设计
4、临床试验中的AMPs
5.6 作为抗菌药物的其他纳米结构
6.4 抗菌涂层
近几十年来，抗生素的频繁和不规范使用，导致细菌耐药性问题成为公共安全危机。根据美国疾病控制与预防中心（CDC）的最新调查，抗生素耐药性每年导致全球数百万人患病，预计到2050年，因抗生素耐药性导致的死亡人数将达到上千万。因此，开发新型抗菌药物已成为当务之急。此外，抗生素在畜牧业中作为饲料添加剂已有近60年的历史，虽然抗生素在提高畜禽生长性能和促生长上取得了显著的成效，但随着经济的迅速发展和消费者对食品安全的重视程度不断提高，抗生素残留带来的危害也愈演愈烈。考虑到全球生产的抗生素一半以上应用于养殖行业，世界上已经呈现出养殖端全面禁用抗生素的趋势，高效、安全饲用抗生素替代品的研发成为迫在眉睫的难题。抗菌肽（AMPs）作为有前景的抗多重耐药菌的生物材料已显示出前所未有的优势。与干扰病原微生物代谢过程的抗生素不同，AMPs通常通过物理破坏微生物细胞膜脂质和诱导细胞内容物泄漏来产生抗微生物作用，因此它们对细菌耐药性进化概率的影响很小（图1）。目前，由于其强大的抗菌潜力和独特的作用机制，AMPs被认为是替代抗生素的理想候选者。迄今为止，抗菌肽数据库（APD）中已经记录3000多个AMPs，涵盖了抗菌、抗真菌、抗病毒、抗寄生虫等功能。
图1 AMPs和一些抗生素作用机制的比较。AMPs 通过物理破坏细胞膜和诱导内容物外泄来杀死细菌。抗生素通过干扰细菌的关键生理过程来杀死细菌。
由于AMPs在对抗各种病原微生物方面表现出显著的效果和优势，因此引起了化学家和材料科学家的广泛关注。结合纳米材料的相关知识，他们制定了许多设计肽基抗菌纳米材料的策略。与游离AMPs相比，肽基抗菌纳米材料表现出更好的生物学效应。首先，纳米结构的形成可以使AMPs的侧链更加紧密，增加正电荷和疏水氨基酸的密度，从而提高抗菌活性。其次，纳米结构的形成可以将 AMPs 限制在刚性构象的超分子支架内，从而避免与生理环境中的盐类和蛋白酶相互作用，提高稳定性。第三，可以通过改变纳米载体的大小来控制AMPs在特定区域的积累，从而避免不必要的毒性。最后，一些环境响应纳米载体，如pH响应水凝胶，为控制和释放AMPs提供了可能性。尽管先进的纳米技术取得了这些成就，但AMPs本身在临床试验中仍存在毒性大、毒理学不明确、稳定性不成熟等缺点，成为其应用的最大障碍，并可能带来令人沮丧的结果。此外，之前的大多数研究都集中在将天然AMPs转化为纳米结构以获得更强的特性，但往往忽略了肽序列本身的固有结构和特性，导致大多数肽基抗菌纳米材料的不良特性无法从根本上解决, 适合实际应用的抗菌材料很少。因此，肽基抗菌纳米材料的研究应从AMPs入手，改变其固有性质，研究影响其选择性和稳定性的结构参数。在这方面，AMPs的系统修饰或设计策略显示出巨大的潜力。迄今为止，已有综述对AMPs的分类、功能、优点和机制进行了详尽的描述。然而，从AMPs的优化设计到肽基抗菌纳米材料的构建及其应用，仍然缺乏全面的综述。因此，在这篇综述中，全面总结了AMPs的设计和优化策略，并讨论了AMPs的结构-功能关系。介绍了基于肽的抗菌纳米材料的制备和调节策略以及生物学优势（图2）。此外，基于肽的抗菌药物具有完全的生物降解性和更好的生物相容性，可以有效解决许多关键的生物医学挑战。考虑到AMPs及其纳米材料在生物医学中的重要性，本文回顾了它们的生物医学应用。最后，展望了AMPs和相关纳米技术的当前障碍和未来挑战。
图2 AMPs及其纳米结构的设计和应用示意图。中心圆圈显示了AMPs的主要参数。第二个内圈代表AMPs的纳米结构或二级结构。
AMPs的抗菌活性受多种结构参数的影响，例如净电荷、疏水性、两亲性和结构倾向（图 3a）。所有参数都是相互关联的，抗菌活性和选择性是它们之间微妙平衡的结果。因此，近几十年来，为了优化AMPs的整体性能，人们采用了单因素修饰来调整AMPs的主要参数。这种方法不仅简单易行，而且有助于深入了解AMPs的各种参数与抗菌活性之间的关系，可以大大降低设计错误率，降低合成成本。为了探索AMPs的结构-功能关系，研究人员对从天然来源分离或合成的AMPs进行了修饰，以达到提高抗菌活性和降低毒性的目的。为了获得目标肽，通常会经过合成、分析、抗菌能力测试和细胞相容性评估等一系列步骤（图3b）。近年来，该领域取得了很大进展，为AMPs性质的合理修饰和优化提供了参考。
图3 a）通过改变主要参数优化天然或非天然AMPs。b）获得目标AMPs的常见评估步骤。
作为AMPs的主要参数之一，正电荷可显著影响抗菌效果。AMPs发挥抗菌活性的必要条件之一是与微生物膜的带负电荷成分相互作用，如细菌膜中的脂多糖（LPS）、脂磷壁酸（LTA）、甘露糖蛋白和磷脂酰肌醇，及真菌真菌膜中的甲壳素和β-1, 3-葡聚糖之间发挥静电作用。因此，推测增加AMPs的净正电荷可以增强分子与膜之间的静电相互作用，使膜聚集肽的数量更容易达到膜破裂的浓度阈值，从而增强抗微生物活性。AMPs的正电荷取决于序列中精氨酸（Arg）、赖氨酸（Lys）和组氨酸（His）的数量。在这三种氨基酸中，His的等电点最低，因此在中性环境下，His几乎不带阳离子。Arg能与两个脂质头部基团的磷酸部分形成强双齿氢键，从而促进膜更深的插入，使AMPs具有更强的膜破坏能力。与Arg相比，Lys的等电点略低，但通常具有更高的生物相容性。为探究电荷对抗菌活性的影响，研究人员对β-防御素-8（AvBD8）进行了系统研究，结果表明其通过替代缬氨酸（Val）和异亮氨酸（Ile）可增强肽AvBD8的抗菌活性与带正电荷的Arg同时用带负电荷的天冬氨酸（Asp）代替 Val 和 Ile 会降低肽AvBD8的抗菌活性。然而，有人提出了不同的观点，发现肽V13K（KWKSFLKTFKSAKKTVLHTALKAISS）的净电荷从+7增加到+10对抗菌活性没有影响，但导致溶血活性显著增加。大量的研究论文提出了类似的观点，净电荷的增加与抗菌活性之间存在一个阈值，超过该阈值，进一步的毒性不仅不会增加抗菌活性，还会导致毒性增加。事实上，原核生物和真核生物之间膜化学渗透势和脂质组成的显著差异在它们的选择性活性有重要的作用。细菌膜结构的阴离子脂质部分暴露在表面，而在真核细胞中，阴离子脂质部分被分解成单层朝向细胞内部，过多的阳离子导致真核细胞中AMP和两性磷脂之间发生静电相互作用，导致选择性丧失。因此，AMPs的电荷量应在合适的范围内，以满足抗菌作用，同时避免毒性。此外，由于革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的膜结构不同，革兰氏阴性菌的外膜表面富含大量带负电荷的LPS，因此大多数AMPs更容易积聚在革兰氏阴性菌表面。尽管大多数AMPs带正电荷，但阴离子AMPs也是不可忽略的部分。阴离子 AMPs通常富含Glu和Asp。有证据表明，阴离子AMPs 在正盐离子（如Zn2+）的帮助下与细菌膜的带负电荷的成分形成阳离子盐桥，从而增强对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的活性。然而，在大多数情况下，细菌膜的负电荷更有可能与阳离子抗菌肽（CAMPs）直接相互作用。因此，阴离子AMPs的作用机制和先天免疫仍不清楚。目前还没有确切的证据证明阴离子和抗菌活性之间的关系。疏水性作为决定AMPs活性的另一个重要参数，通常定义为肽中疏水残基的百分比，它决定了AMPs在膜疏水核中的分布。通过对大多数AMPs的比较分析，发现疏水性氨基酸残基约占氨基酸残基总数的40-60%。这说明AMPs的疏水性与抗菌活性在一定程度上密切相关，改变其疏水性可能是提高抗菌活性的有效途径之一。例如，用 Ile 取代肽 PMAP-37 （GLLLSRLRDFLSDRGRRLGEKIERIGQKIKDLSEFFQS）20和27位的Lys以增加疏水性，发现肽 PMAP-37（K20/27-I）不仅抑制了大多数细菌的生长，而且还表现出对细菌感染小鼠的治疗效果。通过这个例子，证明了增加AMPs疏水性的最简单传统的方法是在序列中替换或添加疏水性氨基酸，这需要充分了解各种疏水性氨基酸的特性。众所周知，氨基酸的疏水性从强到弱依次为色氨酸（Trp）>异亮氨酸（Ile）>丙氨酸（Phe）>亮氨酸（Leu）>半胱氨酸（Cys）>蛋氨酸（Met）>Val>酪氨酸（Tyr）>脯氨酸(Pro) >丙氨酸（Ala）。然而，值得注意的是，疏水性不一定与AMPs的抗菌活性呈正相关。最近，研究人员用单个疏水性氨基酸（Ile、Leu、Ala、Trp、Val 和 Phe）对W4 (RWRWWWRWR-NH2)的C端进行末端标记以设计一系列AMPs。在这6个氨基酸中，只有疏水性最弱的Ala能增强W4的活性，其他疏水性残基降低其抗菌活性。该结果可能是由于添加了疏水性氨基酸导致 AMP 的二级结构发生了变化。重要的是，这意味着各个参数不是独立的，它们相互补充，共同决定了AMPs的抗微生物活性。因此，只考虑AMPs的疏水性而不平衡其他参数可能会得到与设计理念相悖的结果。除了替换或添加疏水性氨基酸外，化学修饰也得到了广泛的应用，已成为提高AMPs疏水性的理想方法。胆固醇和脂肪酸是膜磷脂的重要成分，可以提高 AMPs 与细菌膜的亲和力，并可以通过诱导 AMPs 转化为特定构象来增加抗菌活性。研究表明，肽Chol-37杀菌效果和治疗潜力的提高归因于胆固醇修饰对亲本肽PMAP-37疏水性和二级结构的调节。同样，将不同长度的脂肪酸与肽结合以增加疏水性也可以促进抗菌活性的增强。在另一项研究中，在肽 Anoplin-D4,7(GLLkRIkTLL-NH2)的N端结合脂肪酸并进行二聚化。结果表明，与较长脂肪酸链缀合的肽表现出更好的抗菌活性，但会伴随着细胞选择性的降低。这些研究为 AMPs抗菌活性的疏水控制提供了有价值的见解。因此，疏水性与抗菌活性之间不存在线性关系，在疏水性相对较低的情况下，在阈值范围内增加AMPs的疏水性可以提高抗菌活性。当超过阈值时，过高的疏水性会进一步诱导肽更深地渗透到疏水核中，从而导致宿主细胞破裂并失去细胞选择性。虽然疏水性没有绝对的固定值来确保AMPs具有最佳的抗菌活性，但在设计具有近乎完美选择性的理想AMPs时，疏水性可能需要在一定范围内以确保AMPs能够满足抗菌活性。不超过阈值的要求。根据以往的设计经验，当 AMPs具有最佳细胞选择性时，其疏水性通常不超过70%。二级结构是另一个重要参数，大多数AMPs在水溶液中具有无序结构，进入膜环境后与磷脂相互作用生物分子形成高度稳定的二级结构，对抗菌活性具有重要意义。因此，二级结构是AMP与膜相互作用的基本要素，折叠成规则的二级结构有利于AMP插入细菌膜。事实上，作者认为二级结构对AMPs来说是一把双刃剑。具体而言，一方面，二级结构对维持AMPs的抗菌活性做出了重要贡献。另一方面，规则和稳定的二级结构通常会导致AMPs 的溶血活性和细胞毒性增加。众所周知，蜂毒肽（GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ）由于其稳定的α-螺旋结构而表现出优异的抗菌活性和高溶血活性。因此，二级结构与活性与毒性关系的研究主要集中在两个方面。首先，通过破坏稳定的二级结构降低了AMPs的溶血活性和细胞毒性。Pro 是一种理想的二级结构破坏剂，因为它的亚氨基缺少氢原子。同样，甘氨酸（Gly）由于其侧链小，构象不稳定，也是二级结构的破坏者。使用 Pro 选择性替换 α-螺旋肽中的Phe以尝试提高细胞选择性。该测定的结果表明，Pro 取代有效地降低了AMP对哺乳动物细胞的细胞毒性，而不会影响其抗微生物和抗内毒素特性。此外，在稳定的α-螺旋AMP的中心插入柔性（GG）和刚性（pG）以破坏二级结构可以提高细胞选择性。为了验证这一结论的准确性，灵活设计的不完美的两亲性α-螺旋肽，中心有一个β-转角。这些肽具有很强的抗菌活性，同时如预期的那样保持细胞选择性。值得注意的是，中心β-转角的引入几乎不会影响肽的α-螺旋结构。此外，研究表明，由L-氨基酸组成的α-螺旋AMP的螺旋度也会受到D-氨基酸的影响。也就是说，通过 D-氨基酸破坏 AMP 的螺旋性也可以降低溶血活性和细胞毒性。受D-氨基酸取代的影响，随着D-氨基酸数目的增加，其螺旋度逐渐降低。其次，对于具有无规卷曲构象的 AMP，研究人员试图稳定其结构倾向以提高其抗菌活性。Protegrin-1 (PG-1) 是一种存在于猪白细胞中的 β-发夹AMP，其二级结构由二硫键维持。发现 PG-1 中的二硫键被去除后 PG-1 的抗菌活性就丧失了，所以有人提出增加其β-发夹结构倾向有利于提高抗菌活性的假说。他们使用骨架环肽作为模板设计了一种未环化的类似物。他们证实非共价稳定可以提高β-发夹肽的折叠能力，并验证β-发夹肽需要保持二级结构以保持抗菌活性。尽管已知AMPs的二级结构与抗菌活性和毒性密切相关，但合理设计以达到抗菌活性和毒性之间的最佳平衡以获得高选择性AMPs仍然是一个挑战。两亲性是指分子框架另一侧的疏水和亲水残基的空间分离程度。通常，两亲性通过疏水矩来量化，疏水矩是标准化螺旋中各个疏水氨基酸的向量总和。两亲性α-螺旋是最常见的构象，肽链的主链围绕中心轴呈规则螺旋上升，每3-4个氨基酸残基旋转一次。两亲性α-螺旋肽的亲水表面与带负电荷的细菌膜成分发挥静电作用，随后肽的疏水表面插入膜内，从而增加膜的通透性。早在十多年前，人们就发现两亲性对于AMPs的抗菌活性至关重要。考虑到两亲性的重要性，通常可以通过在序列中删除、替换或添加氨基酸来修饰AMPs，以形成完美的两亲性结构，这成为当时AMPs设计的首选策略之一。然而，研究人员发现虽然具有完美两亲结构的AMPs具有最好的活性，但它们的细胞毒性也有所增加，表明这种完美的两亲结构非选择性地增加了对膜的破坏。因此，尽管两亲性是AMPs发挥其膜穿透机制所必需的，但完美的两亲性结构对于AMPs的最佳细胞选择性并不是必需的。完美的两亲性往往导致杀菌活性和细胞毒性同时增加，不完美的两亲性残基的适当分布更有利于优化细胞选择性。据报道，带正电荷的残基在亲水表面重排，以确保更均匀的分散，这可以提高AMPs的细胞选择性。疏水氨基酸在完整亲水表面的结合也显示出类似的趋势，据报道，在完整亲水表面上放置成对的Trp会降低AMP的溶血活性（图 4a）。最近报道了一种非完美两亲性肽I6（RRIRIIIRIRR-NH2），它对真菌和细菌表现出很强的抗菌活性，同时本研究表明，大多数具有非完美两亲性构象的AMPs表现出更好的广谱抗菌活性。此外，两亲结构不仅限于α-螺旋AMPs，还存在于β-折叠或β-转角AMPs中。同样，两亲性也会影响 β-折叠 AMP 的抗菌活性和选择性。SB056-lin是一种具有广谱抗菌活性的β-折叠肽，通过交换SB056-lin而设计的完美的两亲肽β-SB056-lin增强两亲性的前两个氨基酸残基具有更强的抗菌和溶血活性（图 4b、c）。尽管已经做出很大努力来证明AMP 的两亲性，但仍然很难描述两亲性残基的排列与抗菌活性之间的完整关系。尽管如此，仍有大量明确的证据表明螺旋轮中正电荷和疏水性氨基酸的分布是决定AMPs抗菌活性的关键因素之一，这提醒更多的研究在优化或AMPs 的设计中，可以通过合理调整两亲性来提高选择性。此外，值得注意的是，上面的例子提醒我们在设计或优化 AMP 时尽可能避免完美的两亲性。
图4 a)肽的螺旋结构投影。在完美两亲肽RI16的完全亲水表面引入一对Trp以设计非完美两亲肽PRW4和PRW6，以降低溶血活性。b)非完美的两亲性β-折叠肽SB056-lin。c)通过交换肽SB056-lin的前两个氨基酸残基，设计一个完美的两亲性β-折叠肽β-SB056-lin。
尽管AMPs的单因素修饰取得了一定的进展，但大多数研究往往只考虑一两个关键参数来改造天然AMPs，而没有考虑到AMPs的结构特征和功能多样性，从而在一些研究中引发了争议。在AMPs的几十年发展过程中，研究人员一直在加深对AMPs结构-功能关系的理解。因此，获得 AMPs的方法已经从单因素修饰演变为从头设计。从头设计需要研究人员应用理论知识和逻辑来确定一种经济上可行且具有基本抗菌能力和选择性的短AMPs序列的设计策略。如前所述，当 AMPs与磷脂生物分子相互作用时形成有序的二级结构是其抗菌活性的关键。因此，大多数 AMP 模板都是基于二级结构设计的。α-螺旋是天然蛋白质最常见的二级结构之一，主要有两种模板。早在 2011 年，有人创建了 α-螺旋肽模板（XXYY）n（X =疏水残基，Y = 阳离子残基，n = 2-4）（图5a）。从那时起，对这个模板的研究就从未停止过。例如，有人设计的肽 G(IIKK)3I-NH2。基于上述模板，该模板已被证明可以杀死细菌，同时对正常宿主哺乳动物细胞保持良性。在另一项工作中，他们研究了不同氨基酸取代对肽 G(IIKK)3I-NH2 N 端 Gly和C端Ile理化性质和生物活性的影响（图5b）。他们发现，与C端取代相比，N 端取代对表面活性和螺旋形成的影响较小。在最近的工作中，他们在肽 G(IIKK)3I-NH2的N端连接了一条酰基链，形成了一种自组装的脂肽，并研究了该脂肽的杀菌机制，本研究的主肽链仍然是基于上述模板设计。α-螺旋的另一个典型模板是七肽重复序列 (abcdefg)n。七肽重复序列广泛存在于天然蛋白质和 AMP中，例如蜂毒肽、BMAP-27、BMAP-28。通常，疏水性氨基酸如 Leu、Ile 或Phe置于“a”和“d”位置，为α-螺旋提供驱动力，而带正电荷的氨基酸如Arg和Lys置于除“a”和“d”以外的其余位置。值得注意的是，序列中不得有Pro、Gly等能破坏α-螺旋结构的氨基酸。根据这一结构特点，有人设计了一种包含七肽重复序列的新型AMP模板，其模板为(abcdefg)n-(W)n-(gfedcba)n（“a”和“d”=Leu、Val、Phe或Trp，其余的位置= Arg，n = 1-3）。得益于稳定的α-螺旋结构，这些AMP 不仅表现出高抗菌活性和细胞选择性，而且还表现出内毒素中和能力和耐盐性。两亲性β-折叠 AMP 通常显示出亲水和疏水氨基酸交替的模式，在这种模式中，AMP的疏水残基嵌入膜中，亲水残基指向脂质-水界面。基于这一特点，研究人员开发了一个 β-折叠模板(X1Y1X2Y2)n-NH2（X1 和 X2 = Val、Ile、Phe 或 Trp，Y1 和Y2 = Arg 或 Lys n = 2或3）（图 5c）。设计的β-折叠AMP对多种微生物表现出很强的抗菌活性，同时保持低毒性并具有中和内毒素的能力。经过几十年的发展，对AMP模板的研究越来越全面。近年来，研究人员致力于全面筛选与AMPs二级结构相关的所有参数，并系统地揭示其结构-功能关系。为此，我们使用了一种预测算法设计了最简单的β-发夹AMP模板RWYXYZZRWYXY-NH2，它涵盖了几乎所有可能的氨基酸，包括阳离子残基（X = Arg、Lys、His）、疏水残基（Y =Val、Ile、Leu、Phe）和刚性转向区（ZZ= Pro-Gly、D-Pro-Gly、Asn-Gly）（图 5d）。我们基于此模板建立了一个包含24条β-发夹肽的文库。在通过详细的生物相容性评估后，我们发现肽WKF-PG (RWFKFPGRWFKF-NH2) 和WRF-NG (RWFRNFNGRWFRF-NH2) 在体外和体内具有显著的杀菌和抗炎作用。本研究结果可能会启发研究人员并进一步推动β-发夹两亲物的设计。
图5 a）以（XXYY）n为模板的螺旋轮示意图。b) G(IIKK)3I-NH2（中间）、其 N 端变体（上部，粉红色箭头）和C端变体（下部，黄色箭头）的螺旋轮投影。c) 以 (XYXY)n 作为模板的亲水性和疏水性氨基酸残基的两亲性二元组。d) 以 RWYXYZZRWYXY-NH2为模板的氨基酸组成。
Mishra和Wang首先提出了数据库筛选技术的概念。他们在数据库多步筛选中针对S. aureus（MRSA）肽的关键参数，最终设计了一种肽 DFTamP1（图 6a），可以在60分钟内损坏MRSA 膜的表面。2019年，他们开发了一种数据库衍生肽，可以解决耐药革兰氏阳性菌引起的小鼠感染。同时，他们提出了一个重要而有趣的观点，即肽中的Lys越多，就越有可能无法减少小鼠模型中的细菌负担（图6b）。这与之前体外研究的结果正好相反。其实这是一种数据库衍生技术，不同于以往的AMP设计方法。研究人员可以使用APD（http://aps.unmc.edu/AP/）有效地搜索具有特定特性的肽，并根据数据库中记录的关键参数开发出最可能具有目标活性的AMP。因此，这种方法更具成本效益。近年来，随着大数据和人工智能技术的发展，数据库筛选技术再次成为热点。在这种情况下，我们基于数据库过滤技术筛选了数据库中抗真菌肽的二级结构、基序等特征，并开发了α-螺旋抗真菌肽（图6c）。肽ACR3（LKKLACRLKKLACRLKKCACR）在由耐药真菌引起的角膜炎小鼠模型中显示出良好的治疗效果。因此，数据库筛选技术是设计具有高治疗潜力的 AMP 的一种非常有前途的方法。在一个里程碑式的发展中，我们相信在未来，人工智能可以用于对各种理化参数进行深度学习，这将有可能减少识别目标药物所需的时间，以及 APD使这一切成为可能。
图6 a) 应用数据库筛选技术获得肽DFTamP1的过程。b) 肽 DFTamP1 的优化和体内研究的主要设计肽的氨基酸序列。肽的赖氨酸越多，它在体内发挥作用的可能性就越小。c) 数据库过滤技术确定设计肽 ACR3的二级结构、氨基酸组成、基序和 3D 结构投影。
杂交是一种通过将不同的优势肽组合成新结构来设计新型AMPs的简单而有效的策略。这种方法通常涉及将两种具有强抗菌活性的AMPs或一种具有高毒性和一种低毒性的组合，以获得具有增强的抗菌活性和降低的毒性的嵌合肽。例如，为了提高细胞选择性，有人设计了一系列杂交肽。与亲本肽KFA3相比，杂化肽保持了良好的抗菌活性，同时提高细胞选择性。同样有人设计了一种混合肽 C-L (KWKLFKKIFKRIVQRIKDFLRN)，由 Cecropin A 的疏水N端片段和 LL37的核心抗微生物片段组成。与亲本肽相比，杂交肽C-L的抗菌活性有所提高。在最近的一项研究中，杂合肽CL用于评估肠出血性大肠杆菌 (EHEC) 诱导的肠道感染和肠道炎症的治疗潜力。杂合肽 CL 通过降低肿瘤坏死因子-α (TNF-α)、白细胞介素-6 (IL-6) 和干扰素-γ (IFN-γ) 并影响 MyD88 核因子κB (NF-κB) 调节EHEC刺激的炎症反应的信号通路。虽然一些研究表明杂交肽比亲本肽更有效，但研究人员往往忽略了杂交引起的肽链长度增加导致的合成成本增加。此外，在相同摩尔浓度下，杂交肽中单个氨基酸的浓度高于亲本肽中的单个氨基酸浓度。考虑到这一点后，研究人员将杂化肽与两个单独的亲本肽混合物进行比较，他们发现在某些情况下，两个单独的亲本肽的混合物比杂化肽显示出更强的抗微生物活性。因此，除了杂合之外，直接混合亲本肽的“鸡尾酒”方法也值得考虑。尽管大多数研究人员致力于开发高活性、低毒的广谱AMPs，但在不断探索的过程中，一些AMPs还具有其他类型的生物活性和功能，这极大地激发了研究人员对该领域的兴趣。场地。此外，作为药物输送系统的一部分，多功能 AMP 提供了控制和释放肽基纳米材料的可能性。因此，在本节中，将简要介绍具有靶向能力、细胞穿透能力和pH响应能力的AMPs的设计原理。2.4.1 特异性靶向抗菌肽(STAMPs)的设计无论是抗生素还是AMPs，大多数抗菌药物都具有广谱抗菌活性，这些药物无差别地杀死益生菌和病原菌，导致体内肠道菌群紊乱，破坏健康微生物群与免疫系统之间的稳态。因此，研究人员致力于开发可以针对特定病原体而不破坏正常菌群的AMPs。信息素是介导细菌或真菌细胞间通讯的信号分子。信息素可以以高亲和力与细菌膜上的一些受体结合。信息素的膜靶向性和显著的亲和力使其成为靶向肽域的理想候选者。早在15年前，有人通过将细菌信息素与广谱AMP连接起来，设计了一种能够靶向杀死S. mutans的AMPs。直到今天，这仍然是设计 STAMPs 的推荐方法之一。例如，最近，有人基于粪肠球菌 (E. faecalis) 信息素 cCF10(LVTLVFV) 和AMP 活性区 C4 (WKWKWENGKWKWKW)的融合设计了一个 STAMP。STAMP cCF10-C4(LVTLVFVGGGWKWKWENGKWKWKW) 通过破坏细胞质膜专门杀死粪肠球菌，但对其他细菌没有杀伤作用。自诱导肽 (AIP) 是一种金黄色葡萄球菌 (S.aureus) 信息素，由7-9个氨基酸残基和一个硫内酯大环组成。然而，硫内酯大环化合物昂贵且难以合成。为了节省合成成本，有人创造了一种经济可行的方法来去除硫内酯大环并去除二硫键在目标地区引入。正如他们预期的那样，将靶向结构域 [CASYFC (C1-C6)] 添加到肽S7 (RWWWLL-NH2)的N末端显示了针对金黄色葡萄球菌的靶向抗菌活性。更重要的是，这种肽可减轻由金黄色葡萄球菌引起的皮下感染。随着研究的深入，最近有更多的方法如噬菌体展示技术被报道用于设计STAMPs。噬菌体展示技术是选择与细菌表面结合的肽的宝贵工具，并为设计 STAMP 提供了极好的模板。丝状噬菌体可以通过重组和修饰展示引入基因组的DNA序列表达的外源肽，随后通过特异性细菌的识别和结合，可以将特异性结合靶分子的细菌膜配体筛选出来（图 7a）。此外，先前的研究表明，非特异性AMP与物种特异性肽部分整合形成的STAMP不会对两个区域的独立功能造成有害变化。基于这一理论，我们使用噬菌体展示肽连接窄谱肽以获得STAMP，其对大肠杆菌（E.coli）具有靶向作用（图7b）。同样，有人建了一个与噬菌体展示肽和AMP GNU7杂交的STAMP（图 7c）。合成的STAMP对铜绿假单胞菌具有高度特异性，可以快速杀死混合培养物中的铜绿假单胞菌细胞。除了上述方法外，随着APD的发展和更新，可以得到尽可能多的参数来达到AMPs的针对性杀菌效果。有人使用APD推导出抗MRSA肽的最可能参数（包括净电荷、氨基酸组成、疏水性含量等）基于AMPs数据库过滤技术设计的 AMP DFTamP1 (GLLSLLSLLGKLL) 具有对 MRSA 具有理想的抗菌作用。同样，有人使用数据库过滤技术设计了一批窄谱AMPs。最后，他们成功地鉴定了针对革兰氏阴性细菌（如大肠杆菌和铜绿假单胞菌）的窄谱AMPs。因此，这种依赖数据库过滤技术来设计或优化 STAMP 是一种有效且有前景的策略，并为靶向药物的设计提供了新的见解。上述研究虽然理论上达到了杀灭特定病原体的目的，但本文认为在STAMPs的研究中，有两个重要的问题需要考虑。首先，由于STAMPs的主要目的是解决肠道菌群紊乱，因此应考虑其蛋白酶稳定性。其次，STAMPs 的详细机制尚不清楚。具体来说，STAMPs 可以与细菌膜中的哪些特定成分相互作用，或者它们是否通过非膜破坏机制发挥抗菌作用，这需要进一步研究。
图7 a)噬菌体展示技术的主要过程。b) STAMP的杀菌机理示意图。对于革兰氏阴性菌（大肠杆菌），STAMP 可以与LPS结合破坏外膜的完整性。对于革兰氏阳性菌，STAMP被封闭在细胞外，不能起到杀菌作用。c)通过将铜绿假单胞菌OprF孔蛋白的靶向肽 (PA2) OprF孔蛋白添加到肽NU7来构建杂合肽。
细胞穿透肽 (CPP) 是一种短肽，可以将物质带入细胞。从严格意义上讲，CPPs 不属于AMPs的范畴，但CPPs可以将治疗分子传递到细胞和组织，这表明它们在未来可能成为药物的一部分。大量证据表明，一些细菌不仅可以侵入细胞外组织，还可以在哺乳动物细胞中增殖。然而，现有的抗菌药物对细胞内细菌的疗效非常低。因此，这就需要开发细胞内杀菌药物。目前，消除细胞内细菌的策略之一是将细胞渗透模块与抗菌剂相结合。第一个策略是使用 CPP 将抗生素输送到细胞中以杀死细菌。众所周知，氨基糖苷类抗生素庆大霉素对真核细胞的渗透性较差，不适用于细胞内杀菌药物。为了解决这个问题，研究人员将效应蛋白 YopM 的α1H 和α2H肽表征为CPP，以增加庆大霉素的细胞内递送（图 8a-c）。该方法确实可以提高庆大霉素的胞内杀菌能力，尽管取得了这一进展，但该策略并没有从根本上解决微生物产生耐药性的问题。因此，第二种策略是使用 CPPs 来开发具有抗菌活性的嵌合肽。为了解决细胞内金黄色葡萄球菌相关感染，有人构建了由肽KR-12 (KRIVQ-RIKDFLR-NH2)和CPP TAT (YGRKKRRQRRR) 连接的肽 TAT-KR-12。这种设计使肽能够有效地穿透RAW 264.7并杀死细胞中的金黄色葡萄球菌（图 8d、e）。值得注意的是，这种细胞内杀伤作用不仅限于体外。在皮下感染小鼠的细胞内感染模型中，金黄色葡萄球菌在体内的生长受到显著抑制（图8f，g）。在另一项研究中，有人巧妙地构建了一种由S. agalactiae信息素 (DILIIVGG) 和阳离子 CPP (KERKKRRR)组成的嵌合肽。其中，优化的嵌合肽L2（DILIIVGGGSGKERKKRRR）和L10（DILIIVGGKRRR）利用CPP的特性作为载体，通过胞吞作用杀死无乳链球菌。由此可见，基于CPPs将抗菌药物输送到细胞内的功能是显而易见的，但其具体的跨膜机制有待进一步探索。此外，当CPPs与AMPs结合时，二级结构对跨膜机制的影响以及细胞内杀菌机制也需要进一步研究和完善。
图8 a) α1H和α2H肽的 3D 结构。b) α1H 和 α2H 肽的螺旋轮投影。c) CPP-庆大霉素缀合的示意图。d) 用 TAT-KR-12（右）或未处理（左）处理的金黄色葡萄球菌（上）和大肠杆菌（下）的 SEM 图像。e) RAW 264.7 细胞中活细菌的共聚焦荧光显微镜图像。用药物处理后，活的金黄色葡萄球菌细胞被染成绿色，红色信号代表死细菌。f)小鼠细胞内感染模型中的伤口愈合过程。g)脓肿部位皮肤的组织学评估和革兰氏染色。
当微生物感染伤口时，由坏死的中性粒细胞、组织碎片、纤维蛋白和细菌组成的脓液在伤口处迅速积聚，导致酸性副产物增加，使感染部位局部呈轻度酸性。为了增强肽对病原菌的杀伤作用，避免损伤正常组织，需要开发pH响应型AMPs。pH 响应性AMPs的作用模式通常涉及碱性和酸性氨基酸的质子化和去质子化。组氨酸（His）残基在中性环境中不带电，在酸性环境中带正电，从而提高了AMPs在酸性条件下与阴离子膜相互作用。有人开发了一种阳离子两亲性 α-螺旋 AMP GH12 (GLLLWHLLHHLLH-NH2)。在酸性环境中，肽GH12中His残基的咪唑基团的质子化成为潜在的阳离子供体。因此，与pH 7.2相比，肽GH12对多种细菌的抗菌活性在pH 5.5时增强。他们发现肽 C18G-His表现出pH依赖性抗菌活性。在中性环境中，该肽表现出低活性，从而最大限度地减少对宿主细胞的毒性作用。在酸性环境中，肽对病原微生物得到增强，表明富含组氨酸的肽可用作设计和开发pH响应肽的模型，以治疗发生在酸性pH位点的感染。目前，pH响应型AMPs的开发在很大程度上依赖于体内外抗菌活性的评价。在体外研究中，肉汤微量稀释法通常用于确定AMPs对微生物的最小抑制浓度 (MIC)。pH响应肽的开发需要确定在非常规pH条件下对微生物的抗菌活性。但大多数微生物最适宜生长的pH值接近中性，培养基pH值的变化会阻碍微生物的生长。因此，未来的研究可能需要为pH响应性 AMPs 建立更标准化的抗菌活性评估系统。
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