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中国农业大学 | Nano Today：抗菌肽的设计、优化和纳米技术：从探索到应用（重磅综述，下）

2021

08/02

微生态

A-

A+

随着可控聚合技术的不断优化和模拟AMPs的聚合物的不断出现，聚合物的设计和合成可能成为未来降低成本的理想替代方案。希望本文能引起越来越多科学家的关注，有助于开发新型高效肽类抗菌药物和饲用抗生素替代品，为这些分子在生物医学和畜牧业中的应用做出重要贡献。

导读

由于畜牧业和医学领域抗生素滥用引起的抗生素耐药性，尤其是多重耐药菌的出现，对人类的健康构成严重威胁，因此迫切需要寻找不产生耐药性和残留的新型抗生素替代品。抗菌肽（AMPs）作为一种天然来源的生物材料，由于其独特的病原菌生物膜破裂机制，近年来成为抗菌制剂，特别是饲用抗生素替代品的热门候选。然而，天然存在的AMPs具有生物活性弱、毒性大、稳定性不成熟等一系列问题，严重限制和阻碍了其转化应用。随着分子设计和优化策略的进步，以及快速发展的纳米技术，在改善AMPs的生物和理化性质方面展现出巨大的潜力，使得AMPs的转化应用和产业化成为可能。在此，本文首先综述了AMPs的设计和优化策略的进展，为开发肽基抗菌纳米材料奠定理论基础，并提供更高效和安全的抗生素替代品。然后，本文总结了肽基抗菌纳米材料的构建策略和生物学效应。最后介绍了抗菌肽在畜牧和生物医学领域的应用，并提出该领域当前面临的挑战和未来展望。

论文ID

原名：Design, optimization,and nanotechnology of antimicrobial peptides: From exploration to applications

译名：抗菌肽的设计、优化和纳米技术：从探索到应用

期刊：Nano Today

IF：20.722

发表时间：2021.07.05

通讯作者：马曦

通讯作者单位：中国农业大学动物科学技术学院

综述目录

前言

1、AMPs的优化

1.1 改变AMPs的电荷

1.2 改变AMPs的疏水性

1.3 AMPs结构倾向的调整

1.4 AMPs两亲性的调节

2、AMPs的重新设计

2.1 设计AMP模板

2.2 AMPs的数据库筛选技术

2.3 杂合型AMPs的设计

2.4 多功能AMPs的设计

2.4.1 特异性靶向抗菌肽（STAMPs）的设计

2.4.2 具有细胞内杀菌能力的AMPs的设计

2.4.3 pH响应AMPs的设计

3、提高AMPs稳定性的策略

3.1 提高AMPs的蛋白酶稳定性

3.1.1 氨基酸的合理排列

3.1.2 与蛋白酶抑制剂结合

3.1.3 非天然氨基酸替代

3.1.4 AMP模拟物设计

3.1.5 末端修饰

3.1.6 环化

3.2 提高AMPs的盐稳定性

3.2.1 优化AMPs参数

3.2.2 多价AMPs的设计

4、临床试验中的AMPs

5、AMPs中的纳米技术

5.1 仅含氨基酸的自组装AMPs

5.2 带有脂质或烷基尾的AMPs的自组装

5.3 AMPs-金属纳米颗粒结合物

5.4 模拟AMPs的聚合物纳米结构

5.5 肽多糖纳米粒

5.6 作为抗菌药物的其他纳米结构

6、AMPs及其纳米材料的应用

6.1 替代饲用抗生素，改善动物健康

6.2 伤口愈合和皮肤感染

6.3 微生物全身感染的治疗

6.4 抗菌涂层

7、结论与展望

主要内容

5、AMPs中的纳米技术

尽管已经成功探索了一系列AMPs设计或优化策略以提高活性、降低细胞毒性和提高稳定性，但这些策略存在一些缺陷，限制了它们在临床治疗中的应用。例如，大多数AMPs可能需要全身给药达到局部浓度，这可能会引起副作用。体内释放的AMPs水平的逐渐降低可能导致亚抑制浓度诱导细菌耐药。为了克服上述问题，除了改变和修饰AMPs外，由纳米结构形成的AMPs递送和控释系统最近成为一种很有前景的方法。肽基纳米材料的构建有助于提高AMPs的原始生物活性，从而降低给药剂量和频率。此外，纳米给药系统可以减轻AMPs的药代动力学/药效学缺陷，提高其保质期、稳定性和生物利用度，延长AMPs的半衰期。近年来，随着纳米技术的发展，已经产生了多种基于肽的抗菌纳米材料，如自组装 AMPs、AMPs-金属纳米颗粒偶联物、AMP-聚合物偶联物。在本节中，本文将介绍与AMPs相关的纳米技术。

5.1 仅含氨基酸的自组装AMPs

当肽序列仅含有氨基酸时，氨基酸之间的氢键、离子、疏水和π-π堆积相互作用是自组装的主要驱动力。超分子自组装被认为是提高 AMP 抗菌活性和稳定性的方法之一。此外，自组装肽纳米材料的开发主要集中在药物递送领域，因为这些材料可以提高细胞相容性水平并延长半衰期。2001年，研究人员报道了一种具有偶数个交替D-和L-氨基酸的环肽，它可以组装成β片状纳米管结构，并通过膜穿透导致细菌快速死亡。这种环肽稳定性好，为探索这些环肽开辟了广阔的空间纳米材料。2013 年，研究人员制备了AMP CL-1 (FLGAL-FRALSRLL)。肽 CL-1 在生理条件下自组装成纳米纤维。与游离肽相比，自组装肽纳米纤维在人血清中表现出更好的稳定性。因此，自组装是提高肽稳定性的直接原因。最近，研究人员通过在亲本肽 PTP-7 (FLGALFKALSKLL) 的 N 端或 C 端添加一对 Glu和Asp，设计了自组装肽EN (ENFLGALFKALSKLL) 和NE (FLGALFKALSKLLNE)。尽管这两种肽具有不同的纳米结构，但它们都在疏水环境中表现出 α-螺旋构象（图 13b）。肽EN中带正电的Lys和带负电的Glu在螺旋轮的分布上相距很远，侧链的相反电荷阻碍了分子的内部相互作用，因此，完整疏水表面上的氨基酸促进肽纵向自组装成纳米原纤维，相反，在肽NE中，相邻的Glu和Lys产生分子内静电相互作用，促进肽自组装成胶束结构（图13a、c）。此外，与游离AMPs相比，自组装肽基纳米材料具有更好的稳定性。在 10% 的人血清中，游离肽PTP-7的半衰期约为10小时，而自组装肽EN和NE的半衰期有效延长，均大于24小时（图 13d）。这一结果表明自组装可以有效地保护肽免受血清中蛋白酶的降解。有一种理论可以解释这种现象，即自组装肽增加氨基酸侧链的密度并形成空间位阻以保护切割位点，限制蛋白酶的可及性和降低对蛋白酶的亲和力。此外，自组装肽由于作为新型生物材料具有优异的抗菌潜力而备受关注。二肽作为最小的自组装模型，为化学修饰提供了广泛的可能性。与传统AMPs的两亲性和阳离子性不同，从二苯丙氨酸自组装的纳米结构是中性和芳香的。据报道，芳香族二苯丙氨酸在水中组装成纳米管结构，而双甘氨酸不能组装，没有二级结构信号（图13e，f）。二苯丙氨酸自组装纳米管可以诱导细菌细胞质膜去极化和应激反应调节因子的上调，导致细菌形态发生变化，而未组装的二甘氨酸对细菌生长没有明显的抑制作用。这表明自组装赋予二肽的抗菌活性。末端修饰的自组装二苯丙氨酸（图13g，h）可以通过类似于表面活性剂的机制穿透生物膜基质，并在10 mg/mL的浓度下消除金黄色葡萄球菌的生物膜。虽然纳米结构在一定程度上提高了肽的蛋白酶稳定性，但序列中所含的α-氨基酸仍有可能被高浓度的蛋白酶切割。因此，在基于肽的纳米材料的设计中，适当引入额外的功能部分，如非天然氨基酸，可以提高自组装AMP的性能和有效性。为了提高超短肽的蛋白酶稳定性和疏水性，研究人员使用二苯丙氨酸作为模板将非天然氨基酸（γ-氨基酸和 D-氨基酸）掺入序列中，并分别在肽的N-和C-末端用叔丁氧羰基和苯乙基修饰（图 14a）。由于杂化分子之间的非共价相互作用，它们在二甲基亚砜的水溶液中自组装成凝胶（图 14b）。Boc-D-Phe-γ4-L-Phe-PEA (NH007)与胃蛋白酶、糜蛋白酶和蛋白酶 K孵育后，其降解率显著低于Boc-L-Phe-γ4-L-Phe -PEA (NH009) (图 14c)，表明 D-氨基酸的存在增强了自组装二肽的蛋白酶稳定性。因此，AMPs的设计和肽基纳米材料的构建是相辅相成的，合理利用AMPs的结构-功能关系可以进一步提高肽基抗菌纳米材料的稳定性和抗菌活性。

图13 a)肽EN和NE的螺旋轮和自组装示意图。b) 肽 EN（左）和 EN（右）在 NaAC（黑色）和 SDS（红色）中的圆二色性 (CD) 光谱。c)肽 EN 和 NE 的 TEM 图像。d)人血清中肽降解的动力学。e)自组装二肽 FF 和 GG 的 TEM 图像。f) 肽FF和GG在超纯水中的CD光谱。e-g)二苯丙氨酸受环境刺激形成纳米管结构。h)自组装二肽FF的SEM图像。

近年来，多肽类抗微生物药物的生物安全性备受关注。除了提高稳定性和抗菌活性外，自组装的另一个重要特征是能够赋予AMPs更强的细胞选择性。从这个意义上说，研究人员使用蜂毒肽作为模型连接(QL)₆诱导分子自组装成纳米纤维（图14d，e），从而调节蜂毒肽的细胞选择性，以达到杀死细菌而不损害宿主细胞的目的。这种方法在一定程度上限制了分子的灵活性，从而降低了细胞毒性。

图14 a)肽 NH007（上）和 NH009（下）的合成。b) 肽 NH007（3% 和 5%）和 NH009（3% 和 5%）凝胶的制备图像（上），以及肽 NH007（0.2%）和肽NH009（0.2%）的SEM图像（下）。c) 在含有蛋白酶 K、胃蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的混合溶液中孵育0小时、12小时、24小时和36小时的肽NH007（上）和 NH009（下）的 RP-HPLC 谱。d) 肽 (QL)₆-Mel和肽(QL)₆-K的共组装示意图。e)含有不同蜂毒肽含量的自组装抗菌纳米纤维的 TEM 图像。

刺激响应纳米材料在治疗细菌感染方面具有广阔的前景。肽可以设计为智能反应材料，在特定环境下触发组装结构和组装能力的变化，从而增强治疗效果或减少对正常组织的毒副作用。最近，研究人员报道了pH控制的自组装肽纳米纤维。在碱性环境中，高 pH 值会中和肽的正电荷并促进肽自组装成纳米纤维（图 15a）。TEM结果显示肽基纳米纤维的直径在增加（图 15b）。此外，肽的二级结构从无规卷曲变为 β-折叠构象（196 nm 处的正峰，218 nm 处的负峰）（图 15c）。在中性环境中，纳米纤维会分解并释放单体。受益于这一特性，该系统表现出强大的可持续抗菌性能和更好的细胞相容性（图 15d-f）。此外，某些细菌可以降低受感染组织的局部 pH 值，这激发了对 pH 值响应的靶向肽基抗菌纳米材料的开发。研究人员设计了富含组氨酸的自组装肽WH9。在中性环境中，肽WH9自组装成纳米纤维，大大增加了细胞相容性。随着pH值的变化，酸性环境会触发 His 质子化，破坏纳米结构的稳定性，并使纳米纤维解体以增强抗菌活性（图 15g-i）。虽然自组装肽基纳米材料表现出优异的抗菌性能和稳定性，但其更详细的作用机制和纳米结构的调控需要进一步探索。

图15 a)自组装纳米纤维的结构随 pH 值变化。b) 纳米纤丝形态和纳米纤丝直径分布的 TEM 表征。c) CD 光谱表征纳米纤维的二级结构。d) 两种纳米纤维对大肠杆菌的抗菌能力。e, f) 两种纳米纤维对 HEK293 的细胞毒性。g) 在酸性感染部位分解pH依赖性自组装纳米纤维。h) 肽WH9在pH 7.4（左）和 5.7（右）下的 TEM 图像。i)依赖于 pH 值的流体动力学尺寸。

5.2 带有脂质或烷基尾的AMPs的自组装

脂质或烷基链-肽缀合物提供了一种创新方法，可以为广泛的生物医学应用创造迷人的纳米级结构。1992 年，研究人员提出了最经典的自组装肽两亲分子模型，它由四部分组成，包括疏水尾、接头、间隔基和亲水头。一旦脂质或烷基链暴露于水环境中，肽的疏水尾部将自身与水分离，以驱动肽自组装形成类蛋白质的分子结构。这个过程类似于蛋白质的自发折叠。具有脂质或烷基尾部的自组装肽基纳米材料可以提供比AMPs本身更强的抗菌活性。基于对自组装机制的理解，研究人员通过在人α-防御素5（HD5）的N-或C-末端肉豆蔻酰化制备胶束形式的自组装纳米颗粒（图16a，b）。与亲本肽HD5相比，纳米颗粒 HD5-myr 表现出更强的抗菌活性，可以在体内杀死 MRSA（图 16c、d）。研究人员设计了一个圆柱形纳米结构并探索了自组装对抗菌活性的影响（图 16e，f）。在他们的研究中，肽ACA-PA是由棕榈酸的疏水尾部自组装，四个Val残基用作β-折叠片段来控制组装结构，四个Lys残基用于保持水溶性.高于临界胶束浓度 (CMC) (50.1 μM)，圆柱形纳米结构的形成增加了阳离子电荷的密度，从而增加了对革兰氏阴性菌的抗菌活性（图 16g-j）。同样，研究人员认为，自组装肽两亲物的 CMC 对抗菌能力的影响值得研究。他们设计了以反平行层排列组装的圆柱形纳米棒结构。该纳米结构由三部分组成，第一部分是由棕榈酸构成的疏水基团作为自组装的主要驱动力，第二部分是由四个诱导纳米棒形成的 Val 残基组成，第三部分是正带电氨基酸以确保肽与细菌阴离子壁的负成分产生静电相互作用。当这些肽的浓度超过 CMC 时，它们的抗菌活性增强，这证明自组装提高了 AMP 的抗菌活性。此外，纳米结构的形成可以延长AMPs的循环时间，避免AMPs在体内被蛋白酶水解。研究人员报道了一种由抗菌脂肽（DSPE-PEG-HnMc）和两亲性嵌段聚合物（PLGA-PEG）自组装而成的胶束。胶束对多种细菌具有优异的抗微生物活性。更重要的是，胶束对P. aeruginosa引起的小鼠肺部感染显示出良好的治疗效果。这种优异的抗菌活性可以通过胶束表面的聚乙二醇 (PEG) 阻止血清中蛋白酶对AMPs的水解来解释。

图16 a)肉豆蔻酰化修饰 HD5 以产生纳米颗粒。b)亲本肽 HD5、myr-HD5 和 HD5-myr 的 TEM 图像。c) 肽处理后感染小鼠的细菌负荷。d) 小鼠器官的组织病理学 H&E染色。e)肽ACA-PA 自组装示意图。f) 1 mg/mL ACA-PA（左）和 2mg/mL ACA-PA（右）自组装形态的TEM图像。g)超过 CMC 的肽 ACA-PA 浓度增强了革兰氏阴性菌的抗菌活性。h-j)用肽 ACA-PA 处理的大肠杆菌的荧光显微镜成像分析。

肽基纳米材料的物理、化学性质和生物学功能与纳米结构有关，因此，通过调节电荷、疏水性、氢键等非共价相互作用，不仅可以提高内在稳定性但也有抗菌作用的活性。为了研究自组装结构与抗菌活性之间的关系，研究人员使用碱性氨基酸（Arg、Lys、His）作为间隔区设计了三种双子肽两亲物。在该系统中，肽两端的烷基链为自组装提供了方向性。三种肽两亲物的临界聚集浓度 (CAC) 由表面张力曲线的断点确定（图 17a、b）。此外，PBS中三种肽两亲物的电荷由 zeta 电位确定（图 17d）。由于生理条件下三种肽的电荷差异，在CAC上方，12-(Arg)₄-12自组装成约100 μm的短棒，12-(Lys)₄-12形成长度为 200-500 μm 的长杆和 12- (His)₄-12形成长度为微米的纳米纤维（图17c）。此外，他们发现短杆状自组装两亲物12-(Arg)₄-12 比长杆状结构表现出更强的膜去稳定能力。值得注意的是，在具有脂质或烷基链的自组装AMPs中，自组装过程由“疏水尾”控制，氨基酸之间的相互作用起次要作用，可以控制肽的组装结构。基于这一理论，研究人员使用更灵活的方法设计了不同的自组装肽两亲物，并研究了它们的抗菌活性与纳米结构之间的关系。在该系统中，缺乏有助于β-片相互作用的氨基酸的肽自组装成胶束，存在有利于形成分子间氢键的氨基酸的肽自组装成纳米纤维，存在氨基酸的肽有利于 π-π 堆叠相互作用自组装成扭曲带（图 17e）。本研究证实，不同的纳米结构影响肽两亲物的抗菌活性，胶束比纳米纤维和扭曲带具有更强的抗菌能力。其作用机制可能是胶束的解体单体插入细菌膜，导致细菌内外膜渗漏（图17f）。此外，肽基纳米材料在特定条件下的形态转变有利于提高治疗效果，延长在感染部位的停留时间。例如，研究人员以油酸和肽LL-37为模型制备pH响应抗菌纳米材料。这种可变形的纳米系统可以根据pH值的变化。圆柱形纳米结构在 pH 7 时不具有抗微生物活性，纳米结构在 pH 5 时转化为胶束，对细菌具有很强的抗菌活性（图 17g，h）。这种pH响应性纳米载体可以通过将活性集中在局部区域来实现药物在体内特定pH区域的被动靶向，有利于提高肽基纳米材料的抗菌效率。研究人员开发了一种自组装短肽两亲物 (sPA)，由C16疏水尾、二酪氨酸和 β-丙氨酸组成。由于Tyr的π-π相互作用，肽两亲物自组装成纳米纤维结构。随后，他们通过使用不同的生物活性过渡金属离子来调节肽两亲物的自组装结构。在Fe(III)金属离子的存在下，获得了长片纳米结构。Co(II)和Ni(II)离子促进了纳米纤维的卷曲和扭曲，Cu(II)离子促进了纳米纤维的解聚。Zn(II) 诱导针状形态。Zn-sPA 混合纳米结构表现出很强的抗菌活性。该研究表明，sPA作为金属离子转运剂治疗细菌感染具有巨大潜力。

图17 a) 肽12-(Arg)₄-12、12-(Lys)₄-12和12-(His)₄-12的表面张力曲线。b) 肽12-(Arg)₄-12、12-(Lys)₄-12 和12-(His)₄-12 的 CAC。c) 由 12-(Arg)₄-12、12-(Lys)4-12和12-(His)₄-12形成的聚集体的冷冻 TEM 图像。d) 肽 12-(Arg)4-12、12-(Lys)4-12和12-(His)₄-12 的Zeta电位。在PBS中e)各种肽两亲物的 TEM 显微照片。胶束 [PA 1 (C₁₂K₅)、PA4 (C₁₈K₅)、PA 7 (C₁₈K-K₅) 和 PA12 (C₁₈R₅)]、纳米纤维 [PA 15 (C₁₈V₃K₅)和 PA 17 (C₁₆V₃A₃K₃)] 和扭曲带[PA 13 (C₁₀F₄K₅) 和 PA14(C₁₆F₃K₃)]。f)胶束可能的杀菌机制。g) LL-37/OA肽的纳米结构和抗菌活性随pH值变化的示意图。h) LL-37/OA 在 pH5（左）和 pH 7（右）下的冷冻 TEM 图像。

5.3 AMPs-金属纳米颗粒结合物

由于AMPs很容易降解，研究人员正在寻找一种简单的方法来制备肽纳米颗粒。众所周知，金属纳米粒子具有广谱抗菌活性，已广泛应用于许多医疗和工业产品、医疗植入物、对抗多重耐药菌。然而，不幸的是，其抗菌作用单个金属纳米粒子往往依赖于高浓度，因为它的抗菌机制是与细菌膜随机物理碰撞然后穿透细胞质产生抗菌作用，而高浓度的金属纳米粒子往往会引起毒性。带正电荷的AMPs可以通过非特异性静电效应使金属纳米粒子更有效地与细菌膜结合，从而达到提高抗菌活性和降低毒性的目的。因此，将这些 AMP 与金属颗粒（如金和银纳米颗粒）直接结合是另一种获得 AMP 纳米颗粒的方法。多粘菌素B是一种抗革兰氏阴性菌的脂肽，可破坏细菌膜结构，诱导细胞内容物外泄。研究人员已经证明多粘菌素B与银纳米颗粒结合可以有效抵抗革兰氏阴性菌，并且在高浓度下不显示溶血活性。金属纳米粒子的另一个主要优点是它们可以随意改变其大小和形状以满足药物输送的标准，利用这个特性，AMP-金属纳米粒子缀合物可以穿透生物屏障，避免动物免疫重新认知机制的影响。在研究人员的研究中，他们将AMPs加载到金纳米颗粒-DNA 适配体偶联物上（图 18a），通过静脉注射将其引入感染创伤弧菌的小鼠体内。这种方法不仅可以减少小鼠的死亡率和器官负荷，但也证明了AMP-金纳米颗粒-DNA 适体缀合物递送系统在体内和体外的有效性（图 18b，c）。

AMPs 共轭金属纳米粒子的优势远不止这些。该方法已被证明是提高 AMP 蛋白酶稳定性的有效策略。研究人员选择了五个与金纳米颗粒相连的代表性两亲性 α-螺旋 AMPs（图 18d）。与游离 AMP 相比，这种纳米结构可以保持 AMPs 侧链的柔韧性，并提高胰蛋白酶的耐受性（图 18e）。此外，与金属纳米颗粒结合的 AMPs 也已被用于增强抗菌活性。2016年，研究人员将银纳米颗粒与 AMPs 结合，他们发现共轭物的抗菌活性明显优于游离AMPs和银纳米颗粒。同样，研究人员报道了金纳米颗粒和青蛙皮肤AMPs衍生物之间的共价结合策略。与游离AMPs相比，共轭纳米粒子对P. aeruginosa的抗菌活性显著增强，并且对胰蛋白酶水解具有更强的抵抗力。研究人员提出了一种一步法合成AMPs共轭金纳米粒子。获得的纳米颗粒具有较高的蛋白酶稳定性和较强的抗菌活性，在全身感染动物模型中显示出良好的治疗效果。研究人员构建自组装GHK-Cu纳米粒子。与 GHK-Cu 单体相比，GHK-Cu 纳米粒子形成更紧密的纳米结构，可以抑制细菌生长更有效。自组装过程提高了GHK-Cu的稳定性生物学功能。在伤口愈合试验中，GHK-Cu 纳米颗粒显示出良好的治疗潜力。通过AMPs共轭金属纳米粒子在这个有前途的研究领域仍有很大的改进空间。目前的研究大多集中在通过金属纳米粒子提高AMPs的稳定性和抗微生物能力。对于更复杂的递送系统，可以通过控制金属纳米粒子的大小来实现被动靶向。此外，可以优化或修改AMPs以使偶联物能够实现其他特定功能，例如细胞渗透、靶向、pH 响应等。

图18 a) 设计负载抗菌肽的金纳米颗粒-DNA适配体偶联物并将其递送至创伤弧菌感染的宿主。b) 治疗后小鼠的存活率。c)治疗后小鼠器官中存活的创伤弧菌计数。d) AMPs结合金纳米粒子的示意图。AMPs的构象变化使它们对胰蛋白酶更具抵抗力。e)五种游离肽被胰蛋白酶快速降解，与金纳米粒子结合的肽在与胰蛋白酶孵育后保持稳定。

5.4 模拟AMPs的聚合物纳米结构

在提高 AMP 蛋白酶稳定性的部分中，我们介绍了模拟AMP 的聚合物。事实上，与AMPs相比，抗菌聚合物除了提高稳定性外，由于其独特的拓扑结构，还具有更好的抗菌活性。例如，将肽掺入星形聚合物使抗菌功效取得巨大进步。研究人员开发了一系列基于阳离子聚 (L-Lys) 的星形多肽。与线性肽相比，这些聚合物表现出更强的抗菌活性。在体内研究中，他们发现这些星形聚合物可以有效缓解EHEC感染并减少炎症。此外，通过自组装在纳米级控制聚合物，可以增加聚合物的局部正电荷浓度，显著增强抗菌活性，这在先前的研究中已经得到证实。一个典型的例子是由线性聚合物自组装的囊泡具有增强的抗菌活性。在另一项研究中，有人设计了一种由肽接枝超支化聚合物自组装的纳米片（图 19a）。由于自组装，聚合物中阳离子Lys单元和疏水Phe单元的局部浓度增加，这增强了纳米片与细菌膜之间的静电相互作用，提高了渗透效率。研究人员通过开环聚合合成基于多肽的胶束（图 19b）。这种胶束不仅具有很强的广谱抗菌活性，而且其内部的阳离子基团可以与细菌细胞外壁的阴离子基团相互作用，进一步促进细菌膜的裂解（图19c）。

图19 a) 自组装纳米片的形成原理和抗菌机制。b) 基于多肽的共聚物自组装成胶束的图示。c) 聚合物胶束的抗菌机制说明。

在最近的一项研究中，研究人员通过Lys和Val N-羧酸酐的开环聚合合成的结构纳米工程抗菌肽聚合物（SNAPPs）是从聚（酰胺胺）树枝状大分子的末端胺引发的（图 20a），其对药物表现出很强的抗菌活性。耐药革兰氏阴性菌。这种聚合物与自组装AMPs的不同之处在于它具有稳定的单分子结构并且可以无限稀释。此外，SNAAPs的作用机制与大多数传统AMPs不同，SNAAPs通过多重互补机制杀死革兰氏阴性菌。在高浓度下，SNAAPs直接破坏细菌的外膜和质膜，导致离子流出（图 20b）。在低浓度下，SNAAPs诱导细胞凋亡，如死亡途径以溶解细胞。因此，细菌很难产生耐药性。此外，肽-聚合物共轭是调节肽基纳米材料生物相容性的有效策略。研究人员对由高度有序的β-折叠结构组成的自组装肽纳米纤维进行聚乙二醇化。由于 PEG 的隐形作用屏蔽了纳米纤维表面的阳离子域，降低了纳米纤维对红细胞的毒性。该研究为提高肽-聚合物组装体的生物相容性提供了重要指导。

图20 a) SNAPPs的合成。b)AMPs（左）和 SNAPPs（右）的可能作用机制之间的比较。c) 肽CS-PEG-LK13自组装示意图和生物膜渗透和杀菌机制示意图 d)铜绿假单胞菌在用肽和抗生素处理的生物膜中的细胞活力。e) 肽和抗生素治疗后的伤口愈合。f)肽和抗生素处理后琼脂平板上的菌落数。g) 肽和抗生素处理后聚二甲基硅氧烷上的菌落数。

5.5 肽多糖纳米粒

多糖作为一种天然高分子，其天然来源广泛，生物降解性强，在多肽偶联中具有重要的应用价值。迄今为止，为了获得更强的抗菌能力，已经有几项研究将 AMP 与一系列多糖（如壳聚糖、纤维素、超支化聚甘油、葡聚糖）结合。在本节中，本文以壳聚糖为例，介绍以壳聚糖为核心的纳米结构的独特优势。

壳聚糖作为甲壳素脱乙酰的产物，具有生物降解性好、价格低廉的特点，其分子内/分子间氢键为设计具有高生物相容性的抗菌药物提供了可能。2017年合成了一种短阳离子肽多糖。偶联物主要由壳聚糖主链和赖氨酸侧链组成。壳聚糖主链的氢键驱动偶联物自组装成纳米颗粒，赖氨酸侧链通过静电作用诱导细菌损伤。由于偶联物的杀菌机理不同于传统的AMPs，它是依靠氢键相互作用而不是氨基酸与细菌膜之间的疏水相互作用来杀灭细菌，因此具有更高的生物相容性。

生物膜在抗菌药物的研究中经常被忽视，但它们是反复感染的罪魁祸首。生物膜是指细菌形成的聚集体，附着在物体表面并分泌一种胞外聚合物（EPS），可以抑制抗菌剂的渗透，从而使细菌的耐受性提高100倍以上。然而，带正电荷的AMPs很容易附着在EPS上，导致对生物膜中细菌的杀灭作用有限。研究人员构建了AMPs和壳聚糖的缀合物，并添加了PEG作为接头。在水性环境中，肽位于核心，聚乙二醇位于纳米颗粒表面，有效屏蔽了正电荷对生物膜渗透的负面影响，在细菌膜环境中，偶联物解离并暴露具有膜活性的肽，然后肽转变成α-螺旋构象，从而杀死生物膜中的细菌（图20c、d）。在体内，共轭物减少了在伤口中聚二甲基硅氧烷上生长的铜绿假单胞菌的生物膜，有效地治愈了小鼠伤口，减轻了炎症的发生（图 20e-g）。这种结合物在生物膜渗透和杀菌方面具有显著优势，并提供了一种有效的生物膜控制策略。

纳米技术的飞速发展为疾病治疗带来了新的曙光。例如，在癌症的治疗中，纳米药物可以通过增强渗透和保留（EPR）效应被动靶向肿瘤，从而提高药物疗效。尽管有报道称细菌感染有 EPR 作用，但这种作用很微弱，甚至可以忽略不计。然而，纳米结构的尺寸会影响抗菌效率。具体而言，小尺寸纳米结构具有更强的穿透能力，可以穿透细胞和生物膜，而大尺寸纳米结构在感染部位显示出较长的停留时间。合理使用纳米结构转换策略可以整合大尺寸和小尺寸纳米结构的优点。最近，研究人员开发了体内自组装策略，以在病理部位诱导自组装，以便纳米药物可以在目标部位积累和保留。他们称之为组装诱导保留 (AIR) 效应。受到这种生物医学效应的启发，研究人员设计了一种壳聚糖-肽缀合物，它包含一个壳聚糖主链、一个 PEG 拴系酶可裂解肽和一个AMPs，并自组装成纳米颗粒（图 21a）。被明胶酶切割后，纳米颗粒变成纤维状纳米结构并在感染区域停留很长时间，从而提高了抗菌效果（图21b，c）。这种基于肽的纳米材料的可切换形态策略显示了在感染部位长期滞留的优势，可以延长给药间隔和降低毒性作用，提高肽基纳米材料的抗菌效率和安全性。抗微生物药物。

图21 a) 壳聚糖-肽结合物自组装和酶诱导形态转化的原理。b) 微生物感染微环境中壳聚糖-肽偶联物的原位形态转化。c) 用明胶酶(10 μg/mL)处理不同时间的壳聚糖-肽缀合物的TEM图像。

5.6 作为抗菌药物的其他纳米结构

除了上述常见的纳米输送系统外，研究人员还研究了其他一些纳米结构。例如，碳纳米点和硅衍生的纳米结构也用于递送基于肽的抗菌药物。研究人员使用介孔二氧化硅纳米粒子作为载体来传递 AMP LL-37，并研究了纳米粒子的孔隙率和电荷对负载的影响。与无孔二氧化硅纳米粒子和带正电荷的二氧化硅纳米粒子相比，阴离子介孔二氧化硅纳米粒子具有更高的负载能力。此外，AMP LL-37 隐藏在阴离子介孔二氧化硅纳米粒子中，降低了对蛋白酶的敏感性。2009 年，研究人员设计了一种由两亲肽 CG3R6TAT 自组装形成的核壳结构纳米粒子。两亲肽CG3R6TAT由驱动自组装的胆固醇、三个Gly残基、六个Arg残基和细胞穿透肽 TAT 组成。纳米颗粒的形成极大地增强了其抗菌活性。这些纳米颗粒可以穿透血脑屏障并抑制小兔子脑中金黄色葡萄球菌的生长，而不会对肝肾功能造成损害。

最近，研究人员构建了人类防御-6模拟肽 (HDMP)，它由三部分组成：能够与革兰氏阳性菌的LTA 结合的配体肽、β-折叠纤维结构片段和芳香双芘。HDMP 在体外预组装成纳米颗粒，并在体内识别革兰氏阳性菌的LTA后转化为纳米纤维（图 22a-d）。与 LTA 孵育48 h后，动态光散射(DLS)结果显示 HDMP 的直径增加，CD 光谱结果显示 HDMP 的 β-折叠含量增加，并且HDMP紫外-可见光和荧光光谱发生了变化，所有这些都证实了HDMP从纳米粒子到纳米纤维的转化（图 22e-g）。这种策略的优势在于HDPM在体外以纳米粒子的形式存在，这使得更容易达到给药标准。在体内转化为纳米纤维后，可以增强HDMP在感染区域的积累，可以更有效地捕获细菌。此外，将药物有效递送至靶组织对于感染的治疗也非常重要。纳米载体可以促进感染区域抗菌药物的释放，降低正常组织中药物的含量。研究人员构建了一个超分子明胶纳米颗粒，将万古霉素嵌入其中，并用红细胞膜修饰纳米颗粒的表面。红细胞膜赋予纳米粒子免疫逃避能力。感染区细菌释放明胶酶使明胶核降解，使万古霉素在感染微环境中释放以杀死细菌。使用这种策略可以减少药物的用量，减少对正常组织的副作用。

图22 a) HDMP的分子结构和纳米结构转变示意图。b-d)由LTA触发的 HDMP 纳米结构转变过程的TEM图像。e) 动态光散射和f)从纳米颗粒到纳米纤维的HDMP组装的CD光谱。g) HDMP 纳米颗粒和纳米纤维的紫外-可见光谱和荧光光谱。

除了直接杀死感染部位的病原菌外，细菌感染检测对于对抗耐药菌也尤为重要。为此，研究人员构建用于早期检测细菌感染的超分子纳米组件。它由信号分子(Ppa)、酶响应肽接头（PLGVRG）和靶向配体（万古霉素）组成。万古霉素负责细菌的特异性再识别，然后细菌分泌的明胶酶裂解连接子，导致分子空间位阻降低，并诱导剩余部分自组装成扭曲的纤维结构，从而增强光声信号。分子探针能准确灵敏地检测由于其靶向积累和响应保留效应而导致细菌感染。

6、AMPs及其纳米材料的应用

肽类抗菌药物在实际应用中显示出巨大的潜力。虽然前文已经描述了一些肽类抗菌药物在抗菌方面的优越特性，但它们在实际应用中的可行性仍有待进一步系统、全面的分析。为此，在这我们将重点探讨多肽类抗菌药物在动物养殖、生物医药和保健等相关领域发展前景。

6.1 替代饲用抗生素，改善动物健康

抗微生物药物除了在医疗行业得到广泛应用外，还为改善动物健康做出了不可磨灭的贡献。然而，养殖端全面禁用抗生素给畜牧业带来了迫在眉睫的挑战。作为抗生素的理想替代品，安全、高效的AMPs已率先规模化应用于养殖行业，以改善动物健康。据报道，AMPs可以通过抑制炎症的发生和加强肠道屏障来降低动物腹泻的发生率。此外，已经表明AMPs可以改善动物的生长性能，减少肠道致病菌并提高营养物质的消化率。然而，进一步的综合应用似乎需要在AMPs的抗菌效率、毒性和稳定性方面进行全面改进。一系列纳米技术也为将AMPs 输送到动物肠道提供了一种有前途的方法。需要特别注意AMP在动物中的潜在风险和毒性需要系统评估。

6.2 伤口愈合和皮肤感染

伤口和皮肤感染的治疗具有重要的临床意义和紧迫性。事实上，机体的皮肤是抵御病原体入侵的第一道屏障，而且由于皮肤病原体不仅包括细菌，还包括真菌和病毒，因此与抗生素相比，广谱的AMPs可能更有效。更重要的是，AMPs还可以诱导细胞迁移、增殖、血管生成，增强和控制免疫反应，使其成为皮肤感染和伤口治疗的理想选择。

近年来，开发用于伤口愈合的给药系统已成为一种趋势。已经开发了一系列纳米材料，如水凝胶、纳米纤维，作为伤口消毒的伤口敷料。以水凝胶为例，水凝胶是由聚合物组成的水合三维网络，由于其良好的生物相容性和易降解性，具有作为伤口敷料的巨大潜力。此外，抗微生物水凝胶具有吸收组织渗出液、抑制细菌生长和装载多种药物的功能。如上一节所述，AMPs 的自组装依赖于氢键、疏水性和 π-π 堆积。对于氨基酸，pH值的变化会触发质子化侧链并改变分子间的相互作用，因此，AMPs自组装形成的水凝胶为负载药物的控释提供了潜在的pH响应策略。目前，人们已经研究了pH可调水凝胶的抗菌纳米纤维网络促进伤口愈合和负载药物的能力。研究人员开发 pH-可切换抗菌超分子水凝胶。在中性pH条件下，八肽（IKFQFHFD）自组装形成超分子水凝胶，在酸性条件下，水凝胶解离并释放药物，并在20天内治愈被MRSA生物膜感染的糖尿病小鼠的伤口（图23a-c)。

图23 a) IKFQFHFD 在中性和酸性条件下的结构。b) 肽 IKFQFHFD 在中性pH下自组装水凝胶的超分子纳米纤维网络。c) 用于根除生物膜和挽救慢性伤口愈合停滞的pH可调纳米纤维网络的概念图。

虽然这种水凝胶敷料具有许多生物学优势，但不可忽视的是它的粘附性弱，不能促进组织再生。为了使水凝胶具有更好的机械性能，研究人员创造了一种由可见光介导的复合甲基丙烯酰取代的重组人原弹性蛋白（MeTro）/明胶甲基丙烯酰（GelMA）水凝胶（图24a-d）。AMP Tet213 (KRWWKWWRRC) 与聚合物网络的结合为水凝胶提供了抗菌性能。这种MeTro/GelMA-AMP水凝胶具有广谱抗菌活性，在预防感染和促进伤口愈合方面显示出巨大的潜力。

图24 a) MeTro的合成反应原理。b) GelMA 的合成反应原理。c, d) 可见光触发水凝胶的形成。

6.3 微生物全身感染的治疗

除了局部治疗外，AMPs在治疗微生物系统感染方面显示出显著的疗效。败血症是一种常见的全身性细菌感染，对人和动物的健康和生命构成严重威胁。流行病学调查显示，败血症相关死亡约占全球死亡率的20%。与抗生素治疗相比，AMPs的阳离子可以中和革兰氏阴性菌的LPS，在杀死细菌的同时可以降低全身炎症的发生率。考虑到生理血清和盐对 AMP 抗菌活性的潜在抑制作用，开发了一种完美的两亲性α-螺旋肽 WLBU2 (RRWVRRVRRWVRRVVRVVRRWVRR) 来治疗铜绿假单胞菌引起的全身感染。与天然肽LL37相比，高度阳离子化的肽WLBU2更有利于克服生理盐环境。此外，Trp残基的加入使得肽WLBU2获得更强的膜界面亲和力并进一步增强其稳定性。因此，肽WLBU2在解决铜绿假单胞菌全身感染方面的功效得到证实。AMPR-11是线粒体非选择性通道 Romo1 的衍生肽，在疏水环境中是标准的α-螺旋构象，具有广谱抗菌活性。静脉注射10 mg/kg肽AMPR-11治疗败血症小鼠后，肝脏、脾脏和肾脏的细菌负荷显著降低。

上述AMPs在脓毒症治疗中虽然取得了全身作用，但其结构与功能的关系尚未完全阐明。为了解决这个问题，研究人员分析数据库中短肽的特征，并用它们设计具有系统功效的AMPs。根据数据库过滤的结果，他们倾向于设计疏水性高、Arg残基数量少的短肽。有趣的是，他们在短肽中发现了高含量的芳香族疏水氨基酸。因此，在设计中使用了具有高膜界面亲和力的 Trp。随后，经过序列改组、3D结构模拟、氨基酸置换等一系列程序来平衡肽的抗菌活性和细胞选择性，开发出肽horine和verine和来应对系统性细菌感染。正如预期的那样，无论是静脉注射还是腹腔注射，肽类海氨酸和维氨酸都可以降低全身感染小鼠的死亡率，并降低小鼠脾、肺、肾和肝脏中的细菌负荷。

6.4 抗菌涂层

随着现代医学的飞速发展，临床上使用了多种材料，如导尿管、支架、人工关节、隐形眼镜、钛表面、碳纳米管。然而，这些材料在造福人类的同时容易引起细菌感染，给医学界带来了问题。肽类抗菌药物在我国具有广阔的应用前景，由于其优异的抗菌性能和良好的生物相容性，可预防与医疗材料有关的感染。

Melimine (TLISWIKNKRKQRPRVSRRRRRRRRGGRRRR)是一种广谱 AMP，是鱼精蛋白和蜂毒肽的混合物。Melimine通过EDC（1-乙基-3-[3-二甲氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐）偶联共价附着于隐形眼镜表面，可有效防止微生物恶化，有助于减少隐形眼镜诱发的周边溃疡。此外，导尿管是医疗中最常用的插入器械之一，长期使用这些器械很可能引起导尿管相关的尿路感染，这无疑会增加患者的发病率并产生高昂的治疗费用。为了解决这个问题，研究人员报道了在医用塑料聚氨酯上开发抗粘连 AMP E6 (RRWRIVVIRVRRC) 涂层的策略（图 25a、b）。聚氨酯导管表面的栓系肽具有广谱抗菌活性，可防止大多数细菌粘附并抑制浮游细菌的生长（图25c）。在小鼠导尿管感染模型中，AMP涂层的抗粘连和抗菌作用得到进一步证实，细菌荧光成像结果显示，AMP导尿管治疗小鼠膀胱内细菌数量7天后显著下降(图25d、e)。尽管在材料表面加载抗菌药物是一种可行的策略，如何尽可能保AMP的抗菌活性一直是一个难题。在复杂介质中，多种表面相互作用导致细菌粘附和蛋白质相互作用，这决定了表面的整体抗菌活性。此外，聚合物刷的化学性质会影响整体抗菌活性。研究人员将AMP结合到三种不同的聚合物刷上，结果表明聚合物刷会影响抗菌活性（图 25f，g），这可能是由栓系肽的二级结构改变引起的。因此，刷子结构也是表面有效AMP活性的决定因素之一。在另一项研究中中，研究人员分别将肽Dhvar5（LLLFLLKKRKKRKY）的N端和C端共价固定在壳聚糖薄膜上。他们发现肽Dhvar5 阳离子末端（C端）的暴露显著减少了表面上的细菌定植。该研究结果表明，AMPs的固定方向也会影响涂层的抗菌效果。

尽管AMPs在预防与医疗材料相关的感染方面具有很大的应用前景，但仍需要系统的研究来获得AMPs的最佳加载方式。AMPs的表面浓度、吸附方向、二级结构、稳定性以及载体的弹性等特性对整体抗菌活性的影响有待进一步研究。此外，由于医疗植入物AMPs可能直接接触人体内的血清蛋白酶和盐类，为了保持更持久的抗菌活性，AMPs 的蛋白酶和盐类稳定性应该是需要考虑的因素之一。研究人员可以利用前面提到的策略来提高 AMP 的稳定性，从而增加其作为医用涂层的潜力。

图25 a) AMP刷涂层聚氨酯导管的合成。b)导管涂层的表面特征。c) AMP 共轭聚氨酯导管在体外减少细菌粘附和生长。d)导管植入小鼠膀胱后细菌负荷变化的 IVIS 图像。e) 测量未治疗和治疗小鼠的生物发光读数。f) AMP栓系聚合物刷的合成。g) 刷状 AMP 对大肠杆菌的抗菌活性。

7、结论与展望

肽类抗菌药物在对抗多重耐药细菌方面显示出无可置疑的潜力。与游离 AMPs相比，肽基抗菌纳米材料具有更大的适用性，因为它们通常具有更强的抗菌潜力和稳定性。虽然纳米技术赋予了AMPs更强大的特性，但不可忽视的是，生物相容性、抗菌活性和稳定性是设计具有临床应用价值的肽基抗菌纳米材料的重要前提。然而，AMPs 的不良特性导致缺乏适合纳米工程修饰的模板。因此，在努力开发新型纳米结构的同时，应考虑 AMPs 的固有结构和功能，并需要调整参数以获得最佳性能。在这篇综述中，本文总结了提高 AMPs 治疗潜力的优化策略以及高选择性和多功能 AMPs 的设计方法。根据其杀菌机制详细讨论了AMPs的结构-功能关系。此外，考虑到肽类抗微生物药物在体内的稳定性令人担忧，在前面的部分中，本文讨论了如何提高AMPs的蛋白酶稳定性和盐稳定性。非天然氨基酸替代、AMPs模拟物的设计、环化、氨基酸的合理排列、化学修饰策略显示出巨大的潜力。尽管这些方法促进AMPs的发展并开辟了设计思路，但实际应用中还需要仔细考虑药物的安全性和成本效益，才能在现实世界中找到可行的选择。

综上所述，从基础研究到应用，在本文看来，未来肽类抗菌药物的设计需要考虑以下几个方面。首先，要突破临床应用的壁垒，扩大应用范围，必须直面AMPs生物利用度低、稳定性差的问题，这意味着仍然需要开发在生理条件下高度稳定的AMPs。因此，这需要继续使用本文强调的策略开发新型 AMP 以在体内对抗高浓度的蛋白酶和盐。其次，肽类抗菌药物的进一步设计和开发需要交叉创新。微生物学、化学、材料科学领域的科学家需要通力合作。除了不断提高AMPs的内在稳定性和治疗潜力外，他们还应该考虑开发更可行的纳米技术。只有不断发展自组装蛋白结构域，扩大有效AMPs的目录，创造新型纳米技术，才能在短期内催生新一代抗菌药物。第三，进一步探索AMPs及相关纳米材料的处理和应用可能性。尽管最近开发的 AMPs 纳米技术显示出极好的潜力，但这些试验大多数仅限于体外，因此需要更多的动物模型来评估这些优化的AMPs 在体内应用的可行性。此外，肽基纳米材料的药代动力学和药效学评价体系有待进一步完善。第四，面对抗生素耐药菌的频繁出现，尤其是超级细菌和生物膜，我们可以尝试将现有的肽类抗菌药物与抗生素相结合来应对。最后，抗菌肽的生产成本也是需要考虑的问题。固相合成的高价阻碍了AMPs的商业化。随着可控聚合技术的不断优化和模拟AMPs的聚合物的不断出现，聚合物的设计和合成可能成为未来降低成本的理想替代方案。希望本文能引起越来越多科学家的关注，有助于开发新型高效肽类抗菌药物和饲用抗生素替代品，为这些分子在生物医学和畜牧业中的应用做出重要贡献。