首页
快讯
关注
资讯
- 健康
- 科技
- 热点
- 视频
- 产业
- 政策
- 护理
- 投资
- 医改
- 养老
- 疫情
- 人物
- 医保
- 疾病
- 管理
- English
- 临床
- 心血管
- 肿瘤
- 内分泌
- 妇儿
- 感染
专题
专区
知识

欢迎登录体验更多功能

搜索

科研 | Nature：肠道菌群特异性T细胞的胸腺发育历程

2021

08/19

微生态

A-

A+

人类及其的肠道微生物组(菌群)共同进化出一种互惠互利的关系。

编译：微科盟momo，编辑：微科盟木木夕、江舜尧。

导读

人类及其的肠道微生物组(菌群)共同进化出一种互惠互利的关系，在这种关系中，人类宿主为微生物提供了友好的环境，而微生物群为宿主提供包括营养供给和防止病原体感染等许多有益功能。然而，维持这种关系却需要稳定的免疫平衡：既要将管腔内的共生微生物控制在局部，还要同时限制炎症反应。因为，一旦某些细菌进入它们不应该出现的组织或器官，即使是好细菌也会产生坏影响。此前，关于免疫T细胞对肠道细菌的抗原特异性识别已有报道。尽管局部环境决定了效应细胞的分化，但尚不清楚胸腺中微生物群特异性T细胞是如何培养的。在这项研究中，研究人员发现，生命早期定植在肠道中的树突状细胞会长途跋涉，将捕获的微生物抗原从肠道运送到胸腺，诱导胸腺产生针对微生物组的T细胞。然后，T细胞离开胸腺，进入淋巴结、肠道和其他部位，此时，微生物群特异性T细胞有一定的致病潜能或者可以保护自己免受相关病原体的侵袭。通过这种方式，发育中的微生物组形成并扩展了胸腺和外周T细胞库，从而增强了对肠道微生物和病原体的识别。

论文ID

原名：Thymic development of gut-microbiota-specific T cells

译名：肠道菌群特异性T细胞的胸腺发育历程

期刊：Nature

IF：49.962

发表时间：2021.05.12

通讯作者：Matthew L. Bettini&Gretchen E. Diehl

通讯作者单位：美国犹他大学医学院（Matthew L. Bettini）；美国斯隆•凯特琳纪念癌症中心（Gretchen E. Diehl）

实验设计

结果

在人类生命的前三年，肠道菌群的组成逐渐稳定，几乎与成人的相似。这相当于T细胞库的一个扩展期。通过小鼠模型，微生物群对T细胞发育的重要性可见一斑：经抗生素处理过的小鼠和无菌小鼠的肠道T细胞受体(TCR)谱系与具备正常微生物群的小鼠的肠道TCR谱系差别明显，这表明微生物抗原改变了T细胞的发育历程。

1 胸腺中微生物群特异性T细胞的发现

为了研究肠道细菌对胸腺特异性T细胞发育的影响，本研究使用了一种与梭状芽孢杆菌有关的共生微生物——分段丝状细菌(segmented filamentous bacteria，SFB)，这种细菌可以驱动小鼠的Th17细胞的反应。SFB是为数不多的已确认其微生物特异性T细胞受体的共生微生物之一，可以通过特定的MHC-肽四聚体追踪SFB特异性T细胞。我们在无SFB定植(SFB^-)的，断奶(幼年)或12周龄(成年)的SPF级别B6小鼠身上分别种植了SFB。种植2周后，使用流式细胞仪检测T细胞数量，通过四聚体磁珠富集法(I-A^b/SFB3340四聚体)识别SFB特异性T细胞。研究结果表明，幼年小鼠而非成年小鼠，种植SFB 2周后，胸腺中SFB特异性CD4单阳性(CD4⁺)T细胞增多 (图1 a，b)。在建立的SFB特异性TCR转基因小鼠模型中，SFB定植也导致了胸腺CD4⁺T细胞数目的增加。而SFB定植并没有诱导其他SFB特异性的胸腺细胞亚群和与肽四聚体不相关的特异性T细胞的扩增。并且胸腺细胞的总数或成熟度未发生变化，这表明以上反应是一种抗原特异性免疫应答。

大多数SFB特异性CD4⁺T细胞是FOXP3^-CD25^-的，说明它们并不是胸腺调节性T细胞(Treg细胞) (图1 c，d)。而它们中很多为CD24^-TCRβ⁺的T细胞，且表达不同水平的CD44和CD69，表明它们是经历了阳性选择的T细胞。

为了证实SFB特异性CD4⁺T细胞不是外周血来源的，我们给小鼠静脉注射了抗CD45抗体来标记血液中的造血干细胞。与脾脏T细胞(其3%的T细胞来源于血细胞)相比，胸腺中几乎所有的四聚体阳性的细胞都是CD45^-的，证实它们没有参与外周血液循环。为了确认这些细胞是胸腺来源的细胞，我们给RAG2启动子驱动-绿色荧光蛋白(GFP)转基因小鼠(简称RAG2-GFP小鼠)种植了SFB，并用CD73(可标记外周血成熟T细胞)对胸腺SFB特异性CD4⁺T细胞进行染色。结果发现，与大多数的CD4⁺胸腺细胞相似，SFB特异性CD4⁺T细胞为GFP⁺CD73^-，这说明它们是胸腺新输出的T细胞而不是循环细胞。

通过RNA测序(RNA-seq)，进一步鉴定了胸腺SFB特异性CD4⁺T细胞。结果发现，SFB特异性和非特异性T细胞的基因表达与经历了选择过程后的CD4⁺T细胞一致。SFB特异性细胞表现出较高的转录、增殖和TCR信号基因的表达，再次说明这些细胞是准备从胸腺迁出的、选择后的T细胞。

SFB定植可以诱导外周SFB特异性Th17细胞的扩增，并且发现成年小鼠在定植SFB 2周后，其肠系膜淋巴结(MLNs)和回肠中Th17细胞已经扩增(图1 f)。而在幼年小鼠中，SFB种植4周后，外周血中才出现Th17细胞增多(图1 f)，这表明成年和幼年小鼠它们的外周血T细胞动力学存在差异。继续观察发现胸腺SFB特异性T细胞持续扩增；此时，大多数T细胞是CD73⁺的，这表明在外周血中增殖的的细胞已迁移回胸腺。进一步实验发现在小鼠断奶时使用抗生素清除肠道菌群后， SPF小鼠的胸腺细胞密度、CD4⁺细胞和胸腺Treg细胞的数量减少，而无菌小鼠(GF小鼠)则无相应反应，这进一步证实了共生微生物对胸腺T细胞的调节。

图1. 共生细菌定植导致胸腺中细菌特异性T细胞增多。a-d，断奶(幼年)或12周龄(成年)小鼠定植SFB 2周后，与年龄匹配的对照组小鼠之间的比较。a和b，胸腺SFB-四聚体⁺细胞的流式图(a)和数目(b)。c和d，胸腺SFB-四聚体⁺细胞的RORγt和FOXP3 (c)以及CD45事件(d)的代表性流式图。a-d，n=12(幼年对照组、成年对照组、成年SFB组)，n=15(幼年SFB组)。e，RAG2-GFP小鼠(n=7)断奶时种植SFB，2周后胸腺SFB-四聚体⁺细胞的CD73和RAG2事件的代表性流式图。f，MLNs和回肠中SFB-四聚体⁺细胞的频率和数目(对照组：n=6(幼年MLNs和回肠)，n=5(成年MLNs和回肠)；SFB定植组：n=6(幼年MLNs和回肠)，n=10(成年MLNs)，n=5(成年回肠))。g，幼年和成年小鼠定植SFB一周后，与年龄匹配的对照组小鼠之间关于胸腺的SFB特异性qPCR的比较。(对照组：n=10(幼年)，n=11(成年)；SFB定植组：n=10(幼年)，n=11(成年))。

2 胸腺中微生物群DNA的发现

肠道微生物可以穿过 MLNs，但是这些微生物可以到达什么组织和器官尚不清楚。为了研究这个问题，我们将小鼠分为两两对应的四组，分别为幼年对照组和成年对照组、幼年SFB定植组和成年SFB组，并用SFB特异性的16S rDNA引物进行定量PCR(qPCR)来评估对应两组间小鼠肠道的SFB定植情况，对应两组间的结果均具有可比性。其他组织器官的评估结果表明，在幼年但非成年的SFB小鼠的胸腺和MLNs中均发现了SFB。并且，少数小鼠的肝脏和心脏中也存在少量的SFB，但脾脏或肺部未检测到，表明胸腺和MLN中的细菌不是由于微生物渗透到血液中引起的。定植SFB后至少3周内均可在粪便中检测到SFB DNA，而在胸腺和MLNs中，SFB DNA量在定植后一周便达到峰值，2周后便检测不到。在幼年对照组和幼年SFB定植组小鼠中而非成年小鼠中，我们发现总的细菌16S DNA(即来自所有细菌物种的16S DNA)在胸腺和MLNs中水平较高，而在其他被检组织中水平较低。与SFB 16S DNA不同，定植3周后，总细菌16S DNA在胸腺和MLNs中仍能被检测到，这反映了微生物群对肠外部位的定植。为了检测微生物在肠道外分布的普遍性，本研究还利用了一种小鼠共生细菌——大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)进行验证，结果与SFB相似。但我们并未从胸腺和MLNs中分离培养出活的大肠杆菌或其他细菌。

接下来，我们利用16S测序探索了组织中微生物群的多样性。结果在MLNs和胸腺中，在门的水平上检测到了多个微生物，且其与盲肠的微生物门类轮廓一致。和预计的一样，在小鼠断奶时使用抗生素，降低了所有被检组织的细菌DNA水平。

3 CX3CR1⁺树突状细胞扩增胸腺T细胞

我们试图寻找诱导胸腺微生物群特异性 T细胞扩增的抗原提呈细胞(APC)。研究发现，小鼠断奶后，胸腺T细胞亚群的数目增加直至第5周，然后下降至小鼠成年。胸腺树突状细胞(DC)的数量也增加至第5周。与T细胞一样，小鼠断奶时使用抗生素清除肠道微生物群，使得第5周时小鼠胸腺中树突状细胞的数量减少。幼鼠(而非成年鼠)种植SFB或大肠杆菌则会增加胸腺中树突细胞的数量。根据细胞表达的标志物包括整合素CD103和趋化因子受体CX3CR1，可以细分肠道APCs群体。已有研究表明，微生物群可以调控CX3CR1⁺DCs从肠道迁移至MLNs。然而，到目前为止，细胞迁移到胸腺过程中的具体特征仍尚不明确。本研究观察到，小鼠断奶后，其胸腺CX3CR1⁺DCs的数量增加，而CD103⁺DCs数量没有增加，到12周后，CX3CR1⁺DCs的数量减少。此前本研究通过静脉注射抗CD45抗体已经证实胸腺中的CX3CR1⁺DCs不是外周血液循环来源的“污染物”。在幼年小鼠(而不是成年鼠)中，SFB或大肠杆菌定植会增加胸腺和MLNs中CX3CR1⁺DCs的数量和百分比，但不增加CD103⁺DCs的数量和百分比(图2 a)。使用抗生素清除肠道微生物群后会导致胸腺树突状细胞亚群减少。

其他的APCs(B细胞和浆细胞样树突状细胞)在SFB或大肠杆菌定植的幼鼠体内保持不变，只有在成年小鼠和使用抗生素的小鼠中，B细胞数目增加。

为了理解清楚CX3CR1⁺DCs对胸腺中微生物群特异性T细胞扩增的影响，我们使用了一种在CX3CR1启动子下表达白喉毒素受体的转基因小鼠(以下简称CX3CR1-DTR小鼠)，这种小鼠在白喉毒素处理后，其体内CX3CR1⁺的细胞会被全部剔除。使用白喉毒素处理CX3CR1-DTR幼鼠组和其对应的幼鼠对照组，在小鼠断奶时给它们种植SFB。2周后发现CX3CR1⁺细胞缺陷小鼠的胸腺中SFB特异性T细胞的扩增减少(图2 b)，并且胸腺和MLNs中细菌的水平也有所降低。在断奶时种植SFB或E.coli的小鼠中，CX3CR1⁺细胞剔除降低了其胸腺中SFB或E.coli DNA的水平，但不影响细菌在肠道的定植。我们还使用了可选择性剔除CX3CR1⁺DCs和巨噬细胞的转基因小鼠，构建了特异性剔除CD103⁺DCs的小鼠模型。CX3CR1⁺DCs(而不是CD103⁺DCs)被特异性剔除的小鼠的胸腺中，大肠杆菌特异性的DNA和总细菌16S DNA的水平降低。为了进一步确定胸腺中微生物群特异性T细胞的扩增是否需要CX3CR1⁺细胞的抗原提呈，我们使用了另一种小鼠模型，该小鼠经他莫昔芬治疗后，CX3CR1⁺细胞会失去MHC-Ⅱ表达。研究发现在这种小鼠模型中，胸腺中SFB特异性T细胞的扩增减少，而SFB DNA水平或CX3CR1⁺DCs的数量没有变化。

胸腺DCs包含驻留XCR1⁺细胞和定位于胸腺皮质和血管周围的迁移性Sirpα⁺细胞等。而在本研究中胸腺内所有的CX3CR1⁺DCs都是Sirpα⁺的。

为了进一步探索细胞从肠道迁移到胸腺的机制，我们利用了KikGR33转基因小鼠模型——这些小鼠的所有细胞都表达绿色荧光蛋白(GFP)，当它们被照射在405 nm波长的光下时，GFP会被光转化为红色荧光蛋白(RFP)。本研究光转化了幼年和成年KikGR33小鼠的盲肠，并在48h后对其远端组织进行了分析。发现在这两组小鼠的胸腺、MLNs和脾脏中均观察到RFP⁺细胞；且它们中的大多数是MHC-Ⅱ⁺的APCs，这表明盲肠的APCs可向这些组织稳态迁移(图2 c)。不过不同组之间迁移性APCs的组成不同。幼鼠胸腺中的迁移性细胞主要为CX3CR1⁺DCs，而成年小鼠主要为CX3CR1⁻DC和B细胞。并且在幼鼠中，MLN的大多数迁移性细胞是CX3CR1^-DCs，脾则是B细胞，但在成年小鼠中，B细胞却是MLN和脾脏主要的迁移性细胞。

我们分析了胸腺中趋化因子的表达和结肠中CX3CR1⁺DC趋化因子受体的表达，希望能理解这种随年龄增长的差异性迁移特征。发现与幼鼠相比，成年小鼠胸腺中的CCR5配体(CCL3和CCL5)和CX3CL1的表达减少。同时，我们发现随着小鼠年龄的增长，肠道CCR5⁺CX3CR1⁺DCs会选择性丢失。为了确定CX3CR1或CCR5在细胞从肠道迁移到胸腺迁移过程中的作用，本研究用TAK-779(一种CCR5和CCR2的拮抗剂)或抗CCL2的拮抗性抗体处理了SFB定植的野生型或CX3CR1缺陷小鼠。CX3CR1的缺失或CCR5的抑制降低了胸腺SFB DNA的水平，而在TAK-779处理的CX3CR1缺陷小鼠中，没有发现SFB DNA。

图2. 共生微生物定植可导致胸腺中CX3CR1⁺树突状细胞富集。a，幼鼠和成年小鼠种植SFB或大肠杆菌(EC) 2周后，与年龄匹配的对照组小鼠比较其胸腺中CX3CR1⁺DCs的频率和计数(n=15(幼年对照组)，n=20(成年对照组、幼年SFB组、成年SFB组)，n=12(幼年EC组)，n=16(成年EC组))。b，野生型(WT)小鼠和CX3CR1+细胞缺陷小鼠(CX3-DTR)断奶时种植SFB 2周后，两组小鼠胸腺SFB-四聚体⁺细胞的频率和计数的比较(n=5(对照组)，n=6(SFBWT)，n=8(SFBCX3-DTR))。c和d，用405 nm波长的光照射幼年(n=5)和成年(n=9)KikGR33转基因小鼠，两天后收集胸腺、MLNs和脾脏。c，幼年KikGR33转基因小鼠的RFP+MHCII⁺细胞的代表性流式图。d，KikGR33转基因小鼠RFP⁺MHCⅡ⁺细胞的组成。

4 具有功能性的胸腺微生物群特异性T细胞

为了探究扩增的胸腺微生物群特异性T细胞是否对周围组织中的同源抗原有反应，我们使用了T细胞转移性结肠炎模型，在该模型中，初始T细胞注射到免疫缺陷小鼠中会引起肠道微生物依赖性的病理改变。本研究中，在小鼠断奶时给其种植SFB(SFB⁺)或E.coli(EC⁺)，2周后，分离出各自胸腺的初始T细胞，并将它们分别注射到SFB或E.coli定植的RAG2^−/−小鼠体内。与未定植SFB的供者小鼠相比，移植了来自SFB⁺供者小鼠胸腺T细胞的SFB⁺受者小鼠的体重减轻情况和肠道病理程度更为严重，同时免疫浸润增加，Th17细胞的比例更高(图3 a-c)。我们还发现结肠的SFB特异性T细胞的比例和数量增加，且大多数T细胞表达Th17转录因子RoRγt(图3 d)。当EC⁺供者的胸腺T细胞被移植到EC⁺受者小鼠体内时，也观察到了类似的在体重、病理和免疫浸润方面的表型结果(图3 e-g)。与SFB定植得到的实验结果不同，在EC⁺受者小鼠体内，结肠T细胞表达更高比例的Th1转录因子T-bet (图3 h)。我们利用成年小鼠作为T细胞捐献者进行了平行实验。结果没有发现在接受SFB⁺或EC⁺成年供者小鼠的胸腺幼稚T细胞的细菌定植受者小鼠上有更为严重的结肠炎症状。为了证实CX3CR1⁺DCs的作用，我们在断奶时给经白喉毒素处理过的CX3CR1-DTR小鼠和对应的幼鼠对照组小鼠种植SFB(SFB⁺)，并如上述移植胸腺初始T细胞。结果发现，与野生型的幼鼠对照供者组相比，接受SFB⁺的CX3CR1⁺细胞缺陷的幼年小鼠T细胞的受者小鼠在种植SFB后，体重减轻、和结肠炎的情况有所缓解，结肠免疫浸润和SFB特异性T细胞减少(图 3i-k)。同样的结果也出现在移植SFB⁺且CX3CR1⁺细胞上无MHC-Ⅱ表达的的小鼠的胸腺T细胞的受者小鼠上。相比于接受有SPF微生物群小鼠的T细胞的受者小鼠，接受断奶时使用抗生素的供者的胸腺T细胞的受者小鼠的结肠炎严重程度有限。

上述实验已经证实微生物群特异性T细胞能够致病，但我们也想弄清楚扩增的微生物群特异性T细胞是否可以保护机体本身免受感染。肠沙门氏菌肠亚种血清型鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium)与大肠杆菌关系密切，具有交叉反应。本研究在沙门氏菌感染的小鼠中已经发现了与大肠杆菌具有交叉反应的T细胞。为了测试扩增的大肠杆菌特异性T细胞是否能保护小鼠免受沙门氏菌的感染，我们在小鼠断奶给它们不种植(EC^-)或种植大肠杆菌(EC⁺)，2周后，用致死剂量的沙门氏菌感染小鼠。结果发现虽然这两组小鼠的沙门氏菌的定植水平相当，但在沙门氏菌感染后，EC⁺小鼠的存活率增加，而剔除CD4⁺T细胞，这种增加的存活效应则被消除(图3 l，数据未显示)。

图3. 胸腺微生物群特异性T细胞在远端组织中起作用。A-h，小鼠断奶时种植SFB(SFB⁺)或E.coli(EC⁺)，2周后取其胸腺CD4⁺T细胞移植至SFB⁺或EC⁺的RAG2^−/−小鼠。观察4周，并将疾病的严重程度与接受年龄匹配的对照小鼠的胸腺细胞的RAG2^−/−小鼠进行比较。a，e，SFB⁺受者小鼠(a)或EC⁺受者小鼠(e)的相对体重变化。b，c，f，g，SFB⁺(b，c)或EC⁺(f，g)受者小鼠的苏木精伊红(H&E)染色的代表性图片(b，f)和结肠炎评分(c，g)。d和h，结肠SPF-四聚体⁺细胞(d)和Th1细胞(h)的频率和数目。a-d组：n=8(对照组)，n=13(SFB组)；e-h组：n=8(对照组)，n=15(EC组)。i-k，同样将SFB定植、经白喉毒素处理的野生型和CX3-DTR小鼠的胸腺细胞移植到SFB⁺的RAG2^−/−小鼠体内。i，相对体重变化(n=13(WT)；n=14(CX3-DTR))。j和k，HE染色的代表性图片(j)和结肠炎评分(k)(n=6(WT)；n=10(CX3-DTR))。l，小鼠断奶时定植大肠杆菌 (n=11)，2周后用鼠伤寒沙门氏菌(ST)感染，并与感染对照组(n=11)比较存活率。在感染鼠伤寒沙门氏菌之前和感染期间，给EC⁺小鼠注射抗CD4抗体(n=10)或同型对照(IgG)(n=8)后的生存曲线图。

图4. 生命早期胸腺中微生物群特异性T细胞的扩增模型。

讨论

研究结果表明，在幼鼠体内，肠道微生物的定植诱导胸腺T细胞的扩增，而这种T细胞是共生微生物所特有的(图4)。肠道微生物通过肠道CX3CR1⁺DCs呈递微生物群衍生抗原，并以依赖CX3CR1和CCR5的方式从肠道迁移到胸腺，诱导微生物群特异性T细胞的扩增。这与胸腺髓质上皮细胞和其他驻留胸腺的APCs不同，后者便于克隆清除和/诱导胸腺Treg细胞。虽然胸腺微生物群特异性T细胞扩增的分子机制尚不清楚，但微生物非自身抗原可能与肠道微环境诱导的独特的共刺激信号起协同作用。这些数据表明，胸腺在机体再次遇到相同抗原刺激时可以诱导具有不同效应潜能的微生物群反应性T细胞的扩增。那么是否诱导Treg细胞的微生物有类似的胸腺迁移？以及这是否会驱动胸腺T细胞或Treg细胞的扩增？这些研究工作也同样重要。之前的研究已经发现皮肤微生物群特异性T细胞扩增存在发育窗口，未来应进一步探索非肠道部位的微生物群是否也能“教育”胸腺T细胞。了解细菌特异性T细胞在生命早期的发展，包括如何让老年机体重新打开发育窗口和恢复胸腺中细菌特异性T细胞的产生，可为治疗如炎症性肠病等免疫系统紊乱疾病(通过激活细菌特异性免疫反应起作用)和增强机体对病原体的免疫反应提供新的方法。