首页
快讯
关注
资讯
- 健康
- 科技
- 热点
- 视频
- 产业
- 政策
- 护理
- 投资
- 医改
- 养老
- 疫情
- 人物
- 医保
- 疾病
- 管理
- English
- 临床
- 心血管
- 肿瘤
- 内分泌
- 妇儿
- 感染
专题
专区
知识

欢迎登录体验更多功能

搜索

浙江大学 | Nature Plants：水稻种子内生菌塑造了抗病新功能

2021

08/24

微生态

A-

A+

在这项研究中，我们进一步证实了种子内生菌作为植物与环境界面中隐藏的亚组分的重要性。

导读

水稻作为世界主要粮食作物之一，其安全生产对维持我国乃至全球粮食供应起着重要作用。然而，受全球变暖、耕作制度变化等影响，细菌性病害在全球水稻主产区的暴发流行和危害逐年加重，对粮食安全造成重大冲击。深入认识植物抗病性调控机制是构建生态环境友好型病害防控措施的关键基础。已有证据表明，抗病性进化主要由植物先天免疫系统与病原菌的“战备竞赛”所驱动。最近有研究报道，植物微生物群落和植物生长环境可能共同调控着宿主植物的抗病性，但是相关机制目前仍鲜有报道。本研究发现了种子内生菌在“病害三角”中发挥“延伸免疫系统”的作用，表明定向改造内生菌群能为植物抗击病原菌前线加筑“二道防线”。研究人员在筛选水稻抗病性表型时，发现了一种有趣的表型分化现象。呈地理分布特异的分化表型与其种子内生细菌群落结构的差异密切相关，其中鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）在抗性表型中显著富集。进一步研究发现，核心成员瓜类鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas melonis）在抗性表型中世代传递，并可赋予易感表型抗病性；当植物伯克氏菌（Burkholderia plantarii）侵染水稻时，S. melonis分泌胞外信号小分子氨茴酸协同宿主响应，进而干扰B. plantarii毒力因子生物合成通路所依赖的RpoS转录级联反应调控，导致 B. plantarii侵染失败。综上，该研究深入分析了宿主植物与其种子内生菌在响应病原菌胁迫中的共进化规律，提示种子作为植物亲本的“进化遗产”为抗病性资源挖掘和抗病性丧失治理带来了新契机；这对于研发基于微生物组的植物病害精准防控技术具有重要意义。

论文ID

原名：Bacterial seed endophyte shapes disease resistance in rice

译名：水稻种子内生菌塑造了抗病新功能

期刊：Nature Plants

IF：15.793

发表时间：2021.1

通讯作者：王蒙岑；Tomislav Cernava

通讯作者单位：浙江大学农业与生物技术学院，农药与环境毒理学研究所；奥地利格拉茨理工大学环境生物技术研究所

实验设计

结果

1 不同亲本的水稻种子在抗病性上表现出明显的表型

在2016年水稻生长季获得的水稻种子抗Bp感染的表型筛选框架下，发现了一个具有独特性状的独特栽培品种（Zhongzao39）。它在抗病性方面表现出不同的表型，同时具有区域特异性。从S5地区的稻田采集的水稻种子(图1b)显示，在Bp接种的样品中，经过5d的生长后，根系生长完全受到抑制，地上生长(株高)严重受限(图1c)。此外，S5地区水稻的根部有轻微的生长，但在生长10d时出现褐变，不定根数量减少，根毛增殖有缺陷(图1b,d,e)，这与苗期枯萎症状一致。令人惊讶的是，S2、S3和S8地区的稻田种子发芽后，根毛增殖恢复并有轻微褐变，但其主根和不定根以及地上部分的长度分别与对照组相当(图1c、d、e)。

一般来说，病原体接种不成功会导致植物对某些病害的抗性出现假阳性结果。为了测试是否由于接种不足而观察到抗Bp的表型，我们还分析了这些水稻种子的Bp定植和TR水平。结果，通过成功扩增Bp接种种子中的gyrB和Bp的16S-23S核糖体RNA间隔区，获得了水稻种子充分接种Bp的证据，而在对照组中没有检测到Bp分子标志物（图1f）。定量PCR(qPCR)显示，Bp种群密度无明显差异(补充图1b)，但TR的产生遵循S5>S3>S2(e.q.S8)的递减顺序(图1f)。基于幼苗生长或TR水平的聚类分析表明，特定区域种子可分别被划分为抗性表型(S2、S3和S8)和易感表型(S5)(补充图2)。此外，我们观察发现，摆放于琼脂板的生长培养基中的完整且表面灭菌的种子上没有任何可见的菌落形成，这表明种子表面无附生菌。因此我们推测，种子内的内生微生物群可能会影响Bp的毒力，从而对宿主表型的塑造产生生态学影响。

图1. 不同地理产地的水稻种子(Zhongzao 39)在抗病方面的可区分表型。a，采集水稻种子(Zhongzao 39)的区域为S2、S3、S5、S8，分别位于我国水稻主产区浙江省。b，抗病性和易感型水稻种子(Zhongzao 39)的典型表型性状的代表图像。它们是在生长5d和10d后观察的；对于对照，S5地区种子没有接种B.plantarii(Bp)有代表性；对于易感型，S5地区种子接种Bp有代表性；作为抗病性表型，S2地区种子接种Bp有代表性。比例尺，2毫米。c-e，对使用/不使用Bp的区域特异性水稻种子发芽的生长发育表现进行统计分析；两种处理在幼苗茎上有显著差异（P＝1.7×10^-10）(c)。胚根长度(P= 8.3×10^-7)(d)和不定根数(P= 6.8×10^-9)(e)在S5地区中的差异；P值， t检验(双尾)。f，特定区域种子中Bp定植的验证。通过PCR扩增包括gyrB和16S-23S rRNA在内的两个遗传标记检测特定区域种子中的Bp定植；同时定量测定这些种子中的TR水平。不同字母与误差线表示根据单因素方差分析(ANOVA)与Tukey's HSD检验有显著差异(P＜0.05)。数值为平均值±s.d.（显示为误差线；n = 10株幼苗）。

2 抗病表型与独特的种子内生菌的流行有关

对来自4个已确定的具有不同抗病性的地区的水稻种子进行了初步的内生微生物组分析。抗病表型的表面灭菌、发芽的水稻种子表明鞘翅单胞菌属的发生率很高(61.0-92.5%；扩展数据图1a,c)。这些观察首次表明，种子内主要存在的鞘氨醇成员是抗病表型的内在特征。

为了便于深化微生物群落比较的统计分析，并评估细菌群落的特征是否在连续三代植物种子中保持，利用2019年生长季获得的区域特异性种子进行了详细的微生物组研究。证实了在抗病型的细菌群落中，鞘氨醇单胞菌的高流行率（11.8-41.6%；S2>S3>S8），而S5地区易感病的表型又蕴藏着该属的最低相对比例。（6.8%；图2）。与S5地区易感病种子相比，鞘氨醇单胞菌在S2和S3地区的种子中显著富集；在S8地区种子中的富集没有统计学意义（补充数据1）。S5地区的水稻种子在两个收获年度都藏有明显较高比例的伯克氏菌科细菌，2016年收获的种子中，Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia群（S5为68.5%）为优势群，2019年收获的种子中，食酸菌属（Acidovorax）（S5为17.5%）为优势属（扩展数据图1c,d）。当进行群落级比较(β多样性)时，四个区域中的每个区域都由一个独特的种子内部群落反映出来(补充图3a)。然而，Bray-Curtis异质性矩阵内的群落群落对于抗病表型(距离，30.3-50.7%)比任何抗病表型和易感S5种子之间的距离(距离，58.5-67.7%；补充表1)更接近。对种子真菌群落的补充微生物组分析并没有提供植物定殖体的这部分微生物中发生表型特异性特征的迹象(扩展数据图1e,f)。真菌与细菌群落类似，都形成了明显的群落，反映了不同的生长区域(补充图3a)；然而，抗性表型内的群落(距离，29.0-42.3%)与任何抗性表型和易感表型之间的群落(距离，20.7-43.6%；补充表2)没有区别。在所进行的微生物组分析框架中，鞘氨醇菌属细菌被认为是抗病表型中最具有特征性的微生物，这将其与抗病性关系的后续分析成为焦点。

图2. 中的优势菌属。水稻种子(Zhongzao 39)取自中国浙江省不同地区(S2、S3、S5、S8)。它们可分为抗病表型（S2，S3和S8）和易感表型S5（每个区域12个重复，每个重复由来自十个水稻幼苗的100 毫克均匀混合物组成）。圆圈的不同颜色表示每个细菌属的种子来源区域，而大小则与该属在相应区域的相对丰度相关。包括大小代表 5、20 和 40%相对丰度的比较圈。所有样本组中低于5%阈值的细菌属被总结为 "其他细菌"。

3 提高抗病性的内生细菌的特性

为了了解抗病表型的种子微生物组中鞘氨醇单胞菌流行的影响，我们旨在获得有代表性的分离株。此外，我们推测，如果鞘氨醇单胞菌赋予抗病性，那么它很可能在经历Bp感染的种子中持续存在，这与TR的产生有关。因此，TR抗性被认定为与疾病相关的鞘氨醇单胞菌分离物的选择性生理性状。据此，使用环庚三烯酚酮富集培养基(20 mg/L)来促进TR抗性内生微生物的分离。在这些选择条件下，从无Bp的感病种子中没有获得抗TR的菌落，而从Bp接种的易感种子中恢复了抗TR的菌落，随后全部鉴定为Bp（图3a）。这意味着易感表型不藏有耐TR的微生物。令人惊奇的是，从无Bp的抗性种子和接种了Bp的抗性种子中，都能回收到具有TR抗性的黄色素菌落（图3a）。收集的156个黄色素菌落的16S rRNA基因显示彼此相同的核苷酸序列，我们将其命名为ZJ26菌株（NCBI登录号LC500070）。当进行遗传鉴定时，内生菌ZJ26与22种鞘氨醇单胞菌物种具有高度相似性，序列同源性范围为97％至99％，并且在系统发育树中与鞘氨醇单胞菌和水藻链球菌一起形成了单独的后代系（补充图4）。互补的表型特征表明ZJ26和瓜类鞘氨醇单胞菌之间比该属的其他物种关系更紧密（补充表3-5）。随后基于完整的基因组序列与13个鞘氨醇单胞菌菌株进行比较，计算平均核苷酸同一性（ANI）（ANIb> 99.0％；补充数据2），并对ZJ26的基因组序列进行系统发育分析（图3b），证实这是一种瓜类鞘氨醇单胞菌（Sm）菌株。

随后的实验旨在验证Sm对抗病性的影响。回归分析表明，Sm的种群密度与TR水平呈负相关（P <0.001；补充图5）。当分离的菌株用于启动实验时，S5地区种子（易感表型）在抗性表型中观察到的最小细胞密度下用Sm引发后，其表型性状改变为抗病性（图3c）。随后植物体内积累的TR水平显著降低（图3d）。此外，我们通过比较扩增子序列变异体（ASV）的V3-V4区和V4区及其全长16S rRNA基因，在微生物组数据集（补充数据3）中追踪了分离的ZJ26。ASV在当前可实现的最高分辨率下，在基于标记基因的微生物组数据集中代表了不同的微生物分类群。在第一代分析种子（2016年收获）和第三代（2019年收获）中，发现ZJ26与抗性种子的各自最丰富的鞘氨醇单胞菌ASV相同。更深层次的说，Sm具有在代表现代水稻栽培的其他易感品种中赋予（扩展数据图2）和定殖（补充性的图6）抗病性的能力。总体结果证实，Sm是赋予疾病抗性的内生菌，在健康植物种子的微生物组中的世代传递。

图3. 赋予抗病性的种子内生菌的特性。a，通过使用富含TR的培养基(20 mg/L)选择性地筛选被认为参与赋予抗病性的抗TR内生微生物。代表性图像显示，未接种Bp的易感种子（S5）无法恢复出TR抗性菌落；Bp仅在易感种子成功定植后才以TR抗性菌落的形式出现（S5）。从未接种Bp的抗性种子（S2）中回收到抗TR的黄色素菌落，并在Bp接种后共存。比例尺，1cm。b，基于基因组的系统发育树，将具有完整基因组序列的鞘氨醇单胞菌（共13株；来源NCBI）与抗TR的鞘氨醇单胞菌ZJ26一起，根据其基因组的平均核苷酸同一性（ANI）计算的距离值，构建系统发育树。ZJ26被鉴定为瓜类鞘氨醇单胞菌(Sm)。c，Sm ZJ26对易感水稻种子的影响（S5）。在代表图像中：对照，未接种；+Bp+ZJ26(用ZJ26引种)；+Bp(用Bp接种)。比例尺，1厘米。d，分析用/不用ZJ26引种的易感水稻种子的TR水平。e，分析Bp单培养物(Bp)、Bp-Sm共培养物(Bp+ZJ26)和Bp单培养物补充培养的Sm的滤液在36小时(Bp+f36(ZJ26))和72小时(Bp+f72(ZJ26))获得的TR产量。f，用不同溶剂从Sm中提取的小分子对Bp产生TR的影响。二氯甲烷(DCM)、正己烷(HX)、乙酸乙酯(EtOAc)、MR柱(宏树脂，Amberlite XAD16)。根据单因素方差分析（ANOVA）与Tukey's HSD检验，不同字母与误差线表示有显著差异（P＜0.05）。数值为平均值±s.d.(以误差线显示；n = 10株幼苗或三批培养基)。

4 抗病性与鞘氨醇单胞菌衍生的小分子有关

尽管Sm能够在25 mg/L的阈值下降解TR（补充图7），但在添加了50和100 mg/L TR的培养基中，未观察到细胞生长或TR降解。低于15 mg/L时，指数期和平稳期都发生了TR的快速降解（补充图7a-d）以及Sm的快速生长（补充图7e），并且呈现剂量依赖性。此外，Bp单培养中的TR产生量为87.97 mg/L，而Sm-Bp共培养中的TR浓度仅为1.50 mg/L，显著降低率为88％（图3e）。由于Sm的TR降解仅限于25 mg/L的阈值这一事实（补充图7），我们假设共培养物中TR浓度的降低可能归因于Sm分泌的细胞外因子抑制TR产生，而不是其TR降解能力。因此，从Sm ZJ26单培养物中获得的36小时以及72小时滤液处理中，观察到Bp对TR产生的抑制作用（图3f）。有趣的是，在Sm单培养的有机溶剂萃取物中观察到了对TR产生的类似抑制作用，其中乙酸乙酯提取物的活性最高（图3f），但在细胞外沉淀中则没有（补充图8）。

为了鉴定活性小分子并研究其是否与天然生态位中的Sm-Bp相互作用相关，对在体内和体外结合了Bp和/或Sm的水稻种子的不同表型进行了比较代谢分析。在易感种子中，我们发现Bp感染导致TR的大量积累（图4a），但是Bp感染的抗性种子显示出明显的代谢产物模式，其中TR大幅降低并出现13种独有的成分（图4b），但在受Bp感染的易感种子中不存在这些蛋白（图4a）。有趣的是，当易感种子用Sm引发时，我们注意到出现了几种抗性种子特有的化合物，导致代谢模式发生了变化。它们与TR呈负相关，Sm引发仅显著增强了三个成分（图4c，P <0.05）。当在体外培养Sm时，保留了一个与体内TR负相关的成分一致的小分子（图4b，c，d，保留时间，tR = 9.9分钟）。因此假设通过抑制原位TR积累而赋予宿主植物对Bp的抗病性。

5 植物内生菌衍生的小分子的结构和生态意义

为了分离和验证假定的具有抗病性的分子，将接种Sm的培养基进行分级分离。通过生物测定指导的GC-MS分析，在三个活性级分中发现了与TR负相关的成分（补充图9）。将其进一步纯化（补充图9），并在TLC上以254或365 nm紫外（UV）可视化获得蓝色荧光点（Rf值，0.67；显影溶剂，甲醇/二氯甲烷）（图4e，f ）。通过同时使用UPLC-TOF-MS/MS和DAD在254 nm处进行检测，在tR = 4.6 min处的同时峰给出了典型的H +加合物（138.0551，[M + H] +），在m/z处具有三个特征片段65.0415、92.0507和120.0448（图4g-j）。

推断分子式为C₇H₇NO₂.¹H-NMR光谱数据如下（补充图10和补充表6）：δ_H(500 MHz, CD4O, TMS), 7.15 (t, 1H), 7.78 (d, J = 8.0, 1H), 6.68 (d, J= 8.0, 1H), 6.53 (t, 1H).¹³C-NMR光谱数据如下（补充图11，补充表6）：δC (500 MHz, CD4O, TMS), 172.77 (C), 152.54 (C), 134.81 (CH),132.88 (CH), 118.04 (CH), 117.03 (CH), 113.55 (C)。结合从DEPT（补充图12），HSQC（补充图13），HMBC（补充图14）和NOESY（补充图15）获得的其他光谱数据，将该分子鉴定为氨茴酸（AA）（图4k）。

在抗性种子中，AA的平均含量为12.4 mg/kg（补充图16）。因此，我们用相同浓度的纯化合物处理了易感种子，发现在这些由AA引发的易感种子中抗病性得到了显著恢复（图5a，b）。与野生型Sm相比，AA缺陷型Sm突变体（Sm△AA）尽管在水稻上的定居未受影响（图5d）但缺乏AA分泌（补充图17），且对Bp感染的抵抗力受损（图5c）。在Sm△AA-Bp-水稻系统中补充外源AA可恢复对Bp的抗病性（图5c）。

此外，AA的外源启动显著抑制了TR水平（图5e），但不影响幼苗中Bp细胞的生长（图5f），而接种Sm△AA或Sm均未显示对幼苗生长的直接影响（图5g）。同时，我们还评估了AA是否可以在幼苗中诱导免疫反应（易感表型）。结果，AA处理均未显著上调水稻的SA或JA信号传导途径（补充图18）。综合这些结果，发现由Sm赋予的幼苗抗病性主要是由于AA对Bp的直接影响。这也证实了AA在水稻-Sm-Bp三方相互作用中不可或缺的生态作用，可以保护水稻的微生态平衡。

图4. 筛选和鉴定鞘氨醇单胞菌产生的赋予抗病能力的重要信号分子。a，Bp定植的易感种子的代谢谱分析。红色箭头表示TR的积累；绿色箭头表示内部标准。b，Bp定植抗性种子的代谢剖析。13种成分（紫色箭头）与TR的消耗有关。c，Sm引发易感种子的代谢谱分析。与TR负相关的成分（紫色箭头）中，有三个因Sm引发而显著增加（紫色箭头加橙色星号，P <0.05）。d，Sm单培养的代谢谱分析。在保留时间（tR）为9.9 min时观察到假定的活性分子（紫色箭头加橙色星号）。e，f，抑制TR产生的信号分子的可视化。在254 nm(e)和365 nm(f)紫外光(显影溶剂，甲醇/二氯甲烷)下，TLC板上出现蓝色荧光斑。g，h，TOF-MS/MS（g）和UPLC-DAD（h）同时检测活性信号分子（tR约4.6分钟）。TUV，可调紫外线； ChA，通道吸光度； AU，吸光度单位。i，j，活性信号分子的质谱图。发现典型的H +加合物（138.0551，[M + H] +）（i）和m/z 65.0415、92.0507和120.0448（j）的三个特征片段。k，活性信号分子的化学结构鉴定为AA。

图5. 鞘氨醇单胞菌衍生的AA的生态功能。a，AA对易感水稻种子抗Bp感染的影响。如图所示：+ Bp，接种了Bp的易感幼苗； + Bp + AA，接种Bp的AA致敏幼苗；既不进行Bp接种也不进行AA引发。比例尺：1厘米。b，统计比较每种处理的易感水稻种子的生长性能。c，瓜类鞘氨醇单胞菌（+ Sm），AA缺陷型Sm突变体（+ Sm△AA），外源AA（+ AA）不同组合对水稻种子对Bp感染（+ Bp）抗性的影响。d，Sm与Sm△AA的幼苗定植能力比较。e，外源AA对幼苗中Bp产生TR的影响，P值， t检验(双尾)。f，外源AA对幼苗中Bp生长的影响。g，Sm和Sm△AA对幼苗生长的影响比较。根据单因素方差分析（ANOVA）与Tukey's HSD检验，不同字母与误差线表示有显著差异（P＜0.05）。数值为平均值±s.d.(以误差线显示；n = 10株幼苗)。

6 植物内生菌衍生的小分子的作用方式

通过观察整体基因表达，对Bp中分配AA影响的途径进行RNAseq分析。暴露于AA（12.4 mg/L）后，Bp的转录组图谱显示，每对接受相同处理的组的r值等于1.000（补充图19a）。经处理和对照组之间经log₂转换的标准化基因表达的线性回归结果为r = 0.888（补充图19b），表明所获得数据在进一步分析中具有很强的重复性。总共观察到1,645个基因表达的变化（补充图20），其中762个基因显著上调（补充数据4； log₂转换的倍数变化> 1，P <0.05），而883个基因显著下调（补充数据5）。通过KEGG途径富集分析，我们观察到只有一个途径明显富集，如一组显著上调的基因所示（图6a）。相反，有13条通路被显著下调的基因所富集。其中包括抑制的TR产生，其可分为以下六个功能类别：氨基酸，能量和碳水化合物代谢，衰老，细胞运动，细胞群落，膜转运和异生物素生物降解（图6a和补充数据6）。相应的网络分析表明，ABC转运蛋白作为头节点与群体感应和鞭毛组装在一起，形成了受AA影响的主要部分。以苯丙氨酸代谢为主的另一个主要部分是六个单独的途径（图6b）。这些数据表明，AA主要影响与TR生产相关的调节系统和生物合成系统。

在随后的研究中，我们注意到AA对TR产生的抑制作用对BpΔplaI（QS突变体）剂量依赖性增强（补充图21a），而对细胞生长没有明显的抑制作用（补充图21b），这表明受损的QS系统不会降低Bp对AA和TR的敏感性，因此AA更有可能针对涉及TR生产协同控制的上游整体管控体系，例如TCS和RpoS。有趣的是，我们在一系列TCS基因中观察到显著下调，但rpoS中却未见（补充数据5）。随着AA水平的增加，TR积累被显著抑制，但是rpoS的表达没有显著改变（补充图22）。此外，在BpΔrpoS（rpoS突变体）中观察到TR抑制，但是即使存在AA也不会加剧TR抑制（补充图23），表明AA可能与RpoS拮抗。此外，尽管与邻位氨基酸相比，对位和间位形式的活性较低，但几种AA同源物也对Bp的TR产生不同程度的抑制作用（补充图24）。为了进一步验证，使用表面等离振子共振（SPR）生物传感器检查了AA和同源物对RpoS的结合亲和力。SPR分析证明，AA具有与RpoS结合的最高目标亲和力（KD（平衡解离常数）值）（图6c），而对位和间位同源物的KD值较低（图6d，e）。互补分子对接显示AA（与RpoS的相互作用能，30.0787）及其同源物在残基Arg140，Arg208，Arg211，Leu207和Asn204处共享RpoS的显性结合位点，但仅通过常规氢键在残基Gln205上具有固相结合（扩展数据图3），这可能是较高的结合亲和力的原因。

图6. 转录组分析和AA对Bp细胞功能影响的SPR分析。a，KEGG途径中Bp暴露于AA后显著上调和下调的基因。x轴表示KEGG途径富集的P值（距离是log₁₀变换的）。图中的数字显示了每个富集途径中差异表达基因的数量，以及它们在相应途径中所有基因中的比例（括号中）。显著下调的基因的富集途径进一步聚集在六个高级途径/过程中，这些途径/过程以不同颜色的曲线表示。差异表达基因的显著性由倍数变化≥2定义（Wald试验，错误发现率<0.05）。b，显著下调基因与相应富集的KEGG通路之间的关系网络分析。每个基因都用一个青色圆圈表示。这些基因在不同途径中的参与通过代表每种途径的彩色线表示。基因表达的相对倍数变化（log₂转化）由圆圈大小指示。c-e，邻位-AA（c），间位-AA（d）和对位-AA（e）对RpoS的结合亲和力的SPR分析。通过连续稀释获得它们各自对RpoS的结合亲和力的动力学传感图。以共振单位（RU）测得的响应已减去参考值，校正了溶剂并扣除了空白。AA分子的靶结合亲和力用KD（平衡解离常数）值定义，其中KD值越低表示结合亲和力越高。

讨论

迄今为止，在植物种子的内层中已鉴定出131个内生细菌属；然而，只有少数研究描述了种子菌群和宿主健康的潜在影响。长期以来，就其在寄主植物早期定殖过程中的生态功能和作用而言，人们一直低估了种子内生菌群的重要性，以及它们对植物生命周期的重要贡献直到最近才被发现。然而，种子内生菌介导抗病性的潜在机制仍未探索和研究。

植物的各种组织中非致病性鞘氨醇单胞菌的高种群密度引发了1998年的第一个假说，即鞘氨醇单胞菌是与寄主植物相互关联的常见细菌。在随后的几十年中，在拟南芥中发现了有益互作的唯一证据，那里的鞘氨醇被认为是叶际微生物组的重要调节剂。由于缺乏大量和深入的证据表明鞘氨醇单胞菌对其他表型性状的贡献，因此鞘氨醇单胞菌在其他寄主植物中的有益影响尚未发现。在本研究中，我们发现与易感病水稻种子相比，抗病性水稻种子中富含鞘氨醇单胞菌细菌属的不同成员。两个评估时间点之间测序深度的差异，以及先前观察到的种子内部微生物群落的可塑性，很可能归因于3年时间跨度种子内球体鞘氨醇单胞菌相对丰度的差异（扩展数据图1）。然而，很明显，自然发生的鞘氨醇单胞菌种群在种子中连续三代保持着较高的流行率（图2，扩展数据图1和补充图3）。使用依赖培养的方法，我们确认了内生菌瓜类鞘氨醇单胞菌菌株是抗病表型的种子内生细菌群落的核心组成部分，并且它可以连续遗传。更深远的说，它恢复了易感种子对于种子传播的细菌病害的表型可塑性（图3），表明它在塑造对抗细菌疾病的表型可塑性中发挥了作用。

通过一个复杂的框架，包括空间和时间动力学，以及对整体运动适应性的基本功能，对其核心位置的确认进行了深入研究。最近，在全球范围内发现了鞘氨醇单胞菌存在于各种驯化和野生稻种子的微生物群落中，并且根据生物信息学分析，该属被认定为核心微生物组成分。我们的研究根据至少两个性状为鞘氨醇单胞菌在水稻种子内生菌群中的核心位置提供了额外的实验证据。首先，通过种子在连续几代植物中稳定传播。此外，还观察到了与植物宿主的未知生态联系，即抗病表型的形成。尽管如此，“核心微生物组”成员的定义仍在发展中，将来会根据更多植物模型中的预期发现而更精确地定义。总的来说，目前的发现为鞘氨醇单胞菌在宿主种子微生物区系中核心位置的当前定义提供了有力的证据，其在细菌入侵反应中的关键作用突显了这一点。

在Sm-Bp共培养实验的框架中，我们发现Bp在试验条件下显示出比Sm更快的生长速率，并且不受Sm的存在的影响（补充图25a），尽管发生了Sm的TR降解（补充图7）。相反，Bp增强了Sm的细胞生长（补充图25a），这可能归因于Bp分泌的TR的降解（补充图7e）。与水稻幼苗中Sm-Bp互作相关的平行观察（图3）表明，TR固有的降解能力对于Bp感染初期Sm的存活至关重要，而Sm产生的额外的细胞非抑制性分子（补充图25b）对于在“病害三角”中赋予抗病性至关重要。这也表明，种子萌发过程中微生物间的相互作用已证明在水稻中是必不可少的，这在自然系统中也很重要，甚至对于农业系统中的植物健康和生产力也具有决定性作用的。通过详细研究鞘氨醇单胞菌赋予对Bp的抗病性的相互作用机制的框架中，鞘氨醇单胞菌产生的小分子AA对于维持抗病表型至关重要。排除了它触发SA-或JA-相关植物的免疫系统的可能性，相反，微量AA被证明能显著干扰Bp中TR的产生（图5和补充图18），为不同于诱导系统抗性的作用模式提供了证据。进一步的探索表明，AA及其同系物可以与Bp中的RpoS产生拮抗作用，从而导致毒性因子生物合成的调节系统受损。该研究表明，开发AA同源物的衍生物通过其与RpoS蛋白家族的拮抗是对于细菌性植物病害的有效解决途径。在探索AA的活性谱时，我们初步发现AA（每片4-500 µg）在体外对其他主要细菌性水稻病原体（如水稻白叶枯病菌，水稻条斑病细菌和玉米菊欧文氏菌）也具有不同程度的抑制活性（补充图26）。尽管AA的病原体特异活性仍有待进一步研究，但目前的发现表明，AA是水稻生长周期中的重要信号分子，在平衡微环境动态平衡和保护植物免受细菌病原体侵染方面具有生态作用。

与生态作用防御病原菌相反，环境发生与鞘氨醇单胞菌进入植物内部之间的联系仍然知之甚少。值得注意的是，先前描述的分解代谢能力在裸露和种植的土壤中降解广泛分布的外源物质，例如N-杂环（NHs）和多环芳烃（PAHs），可能是水稻种子内生鞘氨醇单胞菌对TR降解能力的重要诱因（补充图7）。除草剂是稻田中的主要外源物质，鞘氨醇单胞菌在种子中的富集可能是由于其亲本长期存在于此类化合物中。有趣的是，通过相同土壤中生长的水稻种子（扩展数据图4），我们发现在具有抗病表型的种子生长的土壤中（S2，S3和S8），鞘氨醇单胞菌的相对丰度（补充图27a）和种群密度（补充图27b）明显高于那些易感表型种子生长的土壤（补充图27）。鞘氨醇单胞菌的不同发生伴随着易感和抗病表型出现区域的不同除草剂胁迫（扩展数据图5）。在S5中施用草甘膦有机磷酸酯时，在S2，S3和S8中混合施用了恶二唑（含O和N的杂环）和喹啉酸（补充表7和扩展数据，图5）。在补充盆栽试验中，与使用相同化合物进行的单独处理相比，使用组合模型的化合物恶二唑和喹啉酸处理的散装土壤中的Sm种群显著增加（补充图28a）。相反，在草甘膦处理中观察到最低的细胞密度，这归因于Sm的结构特异性除草剂降解活性的变化（补充图28b）。另外，草甘膦胁迫和对照相比，Sm富集于暴露于恶二炔或喹啉酸的水稻植株的内层中（补充图28c）。这些观察结果可能是宿主植物响应胁迫而采取的求救策略的一种变体。不管这些初步研究结果如何，环境胁迫在寄主植物内生菌获得和富集中的详细作用以及由此产生的作物表型的调节尚待进一步研究。

结论

自上个世纪以来，植物病流行从病原体-植物-环境相互作用三角的角度进行了广泛的探索。在这项研究中，我们进一步证实了种子内生菌作为植物与环境界面中隐藏的亚组分的重要性。此外，我们还发现，具有抗病性的内生菌可以由寄主植物进行世代遗传，并通过人工方式在流行品种间转移。我们认为，自然发生的种子内生菌可以作为其宿主植物先天免疫的协同成分。为了验证这一点，需要深入了解它们对植物抗病表型出现的意义。目前的研究结果还表明，种子作为植物亲本的进化遗产，为进一步探索本身微生物群在植物生长周期中维持同质状态的作用提供了一个有希望的资源。特别是，对宿主植物及其种子内生菌在不同胁迫下的互惠共生的预期见解，将可能为促进现代作物栽培提供替代解决方案，以应对由植物病害传播引起的全球流行病的挑战。