导读
背景：胆总管结石的发病机制与细菌的作用密切相关。然而，关于胆道微生物在胆总管结石患者临床状况的预测作用以及胆总管结石病中胆道微生物的组成与功能特征还知之甚少。
方法：为了探索胆道微生物的预测作用，我们收集了488例胆总管结石患者的临床资料。我们采用Logistic回归分析的方法分析了常见胆道微生物对胆总管结石患者临床状况的预测价值。首先收集了10例胆总管结石患者的胆汁与相应的十二指肠液样本，然后基于16S rRNA测序和Tax4Fun分析了微生物群落组成和功能。
结果：胆总管结石患者的复发、急性胆管炎的严重程度、住院时间等临床状况与与不同类型的胆道细菌以及耐药菌密切相关。通过16S rRNA测序，我们发现胆道和十二指肠的优势菌群是变形菌门和厚壁菌门。在属的水平上，排名前三的核心菌群是大肠杆菌-志贺氏菌、梭杆菌和肠球菌。在胆汁与十二指肠中，大肠杆菌均是含量最高的菌群。根据α和β多样性结果，胆道与十二指肠微生物群的组成不具有显著差异。线性鉴别分析有效大小算法未发现胆汁微生物的丰度差异特征。在胆道与十二指肠微生物中鉴定出的主要通路与膜转运、翻译、复制与修复、碳水化合物与氨基酸代谢有关。然而，在胆汁与十二指肠微生物间，这些主要通路与抗菌素耐药模式未发现明显差异。
结论：我们的研究首次证明了胆道微生物对胆总管结石患者临床状况的预测价值，并且为胆道与十二指肠微生物的组成与功能特征提供了新见解。胆汁与十二指肠微生物之间的相似性，支持了胆总管结石患者的细菌性十二指肠-胆汁反流理论。同时，在无法获得胆汁样本的情况下，十二指肠液可作为细菌培养与敏感性测试的的替代物。
原名：Biliary Microbiota in Choledocholithiasis and Correlation With Duodenal Microbiota
译名：胆总管结石的胆道微生物群及其与十二指肠微生物群的关系
期刊：Frontiers in Cellular and Infection Microbiology
IF：5.293
发表时间：2021.4.29
通讯作者：吴硕东
通讯作者单位：中国沈阳中国医科大学附属盛京医院普外科
本研究中，大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、粪肠杆菌和粪肠杆菌是胆总管结石患者胆汁中最常见的细菌。与胆汁细菌培养阴性的患者相比，胆汁中培养出大肠杆菌、肺炎克雷伯菌和这两种细菌同时培养出来的患者胆总管结石的复发率分别高出4.16、5.06和4.61倍。胆汁中培养出大肠杆菌和同时培养出大肠杆菌与肺炎克雷伯菌的患者确诊为急性胆管炎的几率分别为4.43和5.62。胆汁中同时培养出大肠杆菌与肺炎克雷伯菌的胆总管结石患者患重症胆管炎的几率增加了11.59倍。与大肠杆菌感染相比，发生鲍曼弧菌或铜绿假单胞菌等细菌感染的患者住院时间延长（OR = 12.75）与转移到重症监护室（ICU）（OR = 3.99）的风险增加。胆汁中同时培养出大肠杆菌与肺炎克雷伯菌的胆总管结石患者转移进ICU的可能性增加了17.80倍。胆汁酸粪肠杆菌感染使患者死亡风险增加了29.33倍（表1）。与非抗菌性耐药菌感染患者相比，抗菌性耐药菌感染的患者胆总管结石与重症胆管炎复发的几率分别增加3.75与5.37倍，但诊断为急性胆管炎的相对几率增加了1.51倍（表2）。表1 胆道细菌预测胆总管结石患者临床病情的Logistic回归模型
表2 胆道抗生素耐药菌预测胆总管结石患者临床状况的Logistic回归模型
测序后，我们在每个样本平均检索到46345条有效序列并进行了分类注释，发现了隶属于32个不同的门和323属的3545种不同的系统类型(OTUs)。胆道与十二指肠中的微生物群的进化树被概括为一个进化分枝图（图1A）。优势门为变形菌门与厚壁菌门。大肠杆菌-志贺氏菌属、梭杆菌属、气单胞菌属、肠球菌属和不动杆菌属在所有的样本中含量均较丰富。Microbiome Analyst平台分析结果表明，胆道与十二指肠样本核心微生物组成在种属水平上相似的，排名前三的是大肠杆菌-志贺菌、梭杆菌和肠球菌。然而，十二指肠核心菌群的组成比胆道微生物显示出更高的多样性（图1B）。胆道和十二指肠微生物的主要门为变形菌门(59.61%和44.50%，P = 0.173)和厚壁菌门(18.24%和30.42%，P = 0.080)(图1C)。在变形菌门的注释物种中，大肠杆菌在胆道和十二指肠微生物群落中均是占比最多的(72.60%和53.88%，P = 0.284)(图1D)。
图1 胆总管结石患者胆道与十二指肠微生物群的组成。（A）胆道与十二指肠微生物群的系统发育树（“P”表示）患者。（B）胆道与十二指肠的核心微生物群。（C）胆道系统与十二指肠在门水平上的微生物群落。（D）变形杆菌门在胆道系统与十二指肠在物种水平上的微生物群落。为了探讨胆道与十二指肠微生物群的相关性，我们首先分别比较了几种革兰氏阴性与革兰氏阳性微生物的相关系数。这些革兰氏阴性与革兰氏阳性微生物通常从伴或不伴急性胆道感染的胆总管结石患者的细菌培养物或胆汁测序分离而来。有趣的是，除了一名患者的一组革兰氏阳性菌外，所有个体的胆道与十二指肠菌群之间的斯皮尔曼相关系数均为正而且具有统计学意义（斯皮尔曼等级相关，P < 0.01）（图2A）。α-多样性表明胆道和十二指肠微生物群的富集和均匀性无显著差异（ACE：P = 0.579；chao1：P = 0.796；Shannon：P = 0.089；Simpson：P = 0.070；observed species: P = 0.921，Wilcoxon秩和检验）（图2B）。主坐标轴分析显示胆道与肠道微生物间没有不同的聚类，在微生物组成方面也没有显著差异（Amova：P = 0.509；Adonis：R2 = 0.049， P = 0.478；Anosim：R = -0.019， P = 0.549）（图2C）。LEfSe结果显示，链球菌属和一种未鉴定的放线菌属是区分胆总管结石患者十二指肠液与胆汁的微生物特征；然而，与十二指肠微生物相比，LEfSe没有确定胆道微生物的特征（图2D）。
图2 胆总管结石患者胆道与十二指肠菌群的差异。（A）每位患者胆道与十二指肠样本的斯皮尔曼相关系数。（B）胆道与十二指肠菌群的α-多样性差异。通过分析ACE、chao1、Shannon、Simpson和observed species指数的箱形图，实现α-多样性可视化。（C）患者胆道和十二指肠微生物β-多样性的差异。通过使用加权Unifrac距离分析主坐标实现了β-多样性的可视化。（D）胆道和十二指肠微生物差异特征的LEfSe分枝图和LDA评分。基于KEGG数据库，我们通过Tax4Fun获得了微生物的功能配置文件。胆道和十二指肠微生物鉴定出的主要通路与膜转运、翻译、复制和修复、碳水化合物代谢和氨基酸代谢有关（图3A）。与微生物组成相似，胆道和十二指肠微生物群的主要的预测的功能谱不具有显著性差异（测功能谱差异并不显著(图3B和补充表S3）。我们也对糖类代谢和氨基酸代谢的次要途径进行了分析和比较。胆道和十二指肠微生物群中，丙酮酸代谢、糖酵解/糖异生、氨基糖和核苷酸糖代谢均富集于碳水化合物代谢中，而丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢则富集于氨基酸代谢中（相对丰度＞1%）（图3C）。然而，胆道和十二指肠的微生物群的次要代谢途径没有明显差异(补充表S4， S5)。我们使用KEGG Mapper分析了胆道微生物的上述代谢途径，并重点分析了各代谢途径中富集的途径。丙酮酸氧化和糖酵解途径在丙酮酸代谢和糖酵解/糖异生过程中更为活跃(补充图S1，S2)。UDP-N-乙酰-α-D-葡萄糖胺（UDP-GlcNAc）与UDP-葡萄糖的生物合成途径富集于氨基糖和核苷酸糖代谢中(补充图S3)。同时，谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酸代谢的富集途径与L-天冬氨酸转化为延胡索酸、L-谷氨酸转化为L-谷氨酰胺及其下游代谢有关(补充图S4)。考虑到抗菌素耐药性已成为胆总管结石和胆管炎治疗的主要问题，我们比较了抗菌素耐药性的预测作用。然而，胆道微生物菌群与十二指肠微生物菌群之间的β-内酰胺酶耐药(Student’s t检验，P = 0.770)、万古霉素耐药(Student’s t检验，P = 0.256)、氨基糖苷耐药(Student’s t检验，P = 0.883)和多药耐药(Student’s t检验，P = 0.564)的差异无统计学意义(图3D)。
图3 胆总管结石患者胆道与十二指肠微生物群的功能预测。（A）KEGG通路注释和基因相对丰度。（B）胆道与十二指肠微生物预测的功能谱。（C）碳水化合物代谢和氨基酸代谢的次级途径的相对丰度。（D）胆道与十二指肠微生物群的与抗菌素耐药性相关基因集的比较。ns，差异不具有统计学意义。 二代测序技术的兴起，以及随之而来的基于生物信息学的分析方法为人类微生物组学研究展示了一个全新的图景。对肠道微生物的研究为很多疾病提供了新的理解与见解。由于胆总管结石的发病机制与细菌密切相关，因此迫切需要更深入地研究胆道微生物。我们的研究强调了基于临床数据通过常见的细菌对胆总管结石患者临床状况的预测价值。而且，通过16S rRNA测序，我们揭示了胆道微生物与十二指肠微生物在组成与功能上的相似性。在门和属水平上，甚至在可识别的物种水平上，胆道与十二指肠微生物总的组成的丰度相似，而且ɑ和β多样性相似。变形菌门和厚壁菌门为优势门，大肠杆菌-志贺氏菌、梭杆菌和肠球菌为主要属。尽管16S测序数据对确定的细菌种类的解释有限，但大肠杆菌是最丰富的物种，这与传统培养数据结果一致。LEfSe发现胆道微生物的分类并不比十二指肠微生物丰富，表明胆总管结石患者的胆汁与十二指肠液中的微生物构成是相似的。之前的一项研究也得出了相似的结论。通过一个持续更新的SILVA rRNA数据库与多种分析方法，本研究可能提供了更综合，更可信的信息。我们对胆道微生物群的研究结果与之前的一项关于新发与复发的胆总管结石患者胆道微生物的研究的结果一致。然而，直到最近才发现，没有任何肝胆疾病的人的胆囊中的胆汁微生物群由以下门组成：厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、放线菌门(Actinobacteria)和变形菌门(Proteobacteria)，其中变形菌门所占比例低于拟杆菌门。相比之下，变形菌门和拟杆菌门的分布改变是胆总管结石患者和无肝胆疾病患者胆道微生物群的主要差异。是什么导致了这些组成性变化呢？与最近的一项对健康人群十二指肠微生物的研究结果相比，本研究的优势门是变形菌门和厚壁菌门，与胆总管结石患者的优势门并无差异。然而，胆管的微生物群在组成和功能上向与十二指肠平行的方向转变。内镜下括约肌切开术(ES)被认为是胆总管结石复发的主要危险因素。内镜下括约肌切开术时总胆管(CBD)孔口的“机械”扩大使细菌从十二指肠进入胆管，这种情况称为十二指肠-胆道反流。然而，杭州市第一人民医院消化内科的研究人员则发现在胆总管结石患者中，有无ES病史的患者胆汁微生物分布无本质差异。这意味着在进行ES之前胆总管结石患者的胆道微生物微生态已经存在改变，很可能是由于Oddi括约肌屏障功能的“病理”性损伤。日本京都大学医学院外科和外科基础科学系的Fukuda等人研究发现，由于十二指肠大乳头丢失导致胆总管的孔径增大，使细菌从十二指肠回流进入胆总管，从而促进了胆总管结石的发展。因此，结合本研究的结果，我们表明胆总管结石患者的胆道微生态的改变可能是由于Oddi括约肌屏障功能受损导致的细菌性十二指肠-胆道反流所致。这种绕过肝脏免疫防御的细菌入侵途径可能最终导致胆总管结石形成的通路可能是合理的。当然，这种假设还没有被证明，有必要进一步验证；然而，需要注意保持Oddi括约肌的功能。细菌的环境发生改变时细菌表现出不同的功能。一种新的定殖的微生物群被认为能够以多种方式存活并抵抗胆道树中胆汁的有害作用。美国加州大学旧金山分校外科和检验医学系免疫化学中心的Wetter报道了胆囊相关细菌和正常菌群外膜特征的差异。本研究对胆道微生物的代谢功能进行了分析，因为它们很少被解释，并且可能与结石形成的发病机制有关。预测的在胆道微生物代谢中显著富集的KEGG通路为碳水化合物代谢和氨基酸代谢。此外，我们推断碳水化合物代谢的富集途径与丙酮酸的主要作用有关。葡萄糖之类的碳水化合物是微生物最主要的碳源；然而，由于胆汁中缺乏葡萄糖，氨基酸等其他成分可能被细菌利用以获得营养和能量。丙酮酸代谢丰度高可能代表了利用不同养分的协同效应。同时，预测的UDP糖的UDP- GlcNAc活性生物合成可能提示与之相关的活性代谢反应，例如，肽聚糖、O抗原和脂多糖的生物合成都与UDP-GlcNAc有关。肽聚糖能够参与适应性反应，允许细菌在胆汁存在的情况下生存。O抗原与胆结石表面生物膜的形成有关，脂多糖在胆道结石的发病机制中起着重要作用。在丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢方面，L -天冬氨酸和L -丙氨酸似乎主要被用作营养物质和能量，而谷氨酸除了提供营养物质外，还可能被转化为L -谷氨酰胺，用于核苷酸代谢等下游代谢。所选择的代谢途径可以反映胆道微生物群在恶劣的胆汁环境中对不同氨基酸的摄取和利用的调控决策。鉴于抗菌素耐药性的越来越多，应尽快对胆总管结石患者，特别是急性胆管炎患者进行样本培养和药敏试验。除了决定抗菌药物的使用，这项研究还证明了胆汁中的特定微生物对患者病情的预测价值。因此，当特定的细菌被检测出来时，应及早采取干预措施。由于胆汁培养的阳性率高于血液，因此TG18指南推荐胆汁为最佳培养标本；在TG18指南中，所有怀疑为胆管炎的病例的总胆管胆汁均应进行细菌培养。然而，值得注意的是，TG18指南也指出大多数轻度急性胆管炎患者不需要胆道引流，除非他们对初始治疗没有反应。这种不一致性提出了如何获取非重症病例的胆汁样本的问题。有趣的是，我们的发现强调了标本来源的另一种选择，因为胆总管结石患者的十二指肠微生物群与胆道微生物群在成分、功能甚至抗菌素耐药性方面具有相似性；并且，通过胃十二指肠镜或胃管获取十二指肠液的方法比胆道引流的方法侵入性和风险更低。然而，这种和观点需要进一步通过样本量更大的临床试验进行验证。据我们所知，这是第一个介绍胆道细菌在胆总管结石患者临床状态中的预测作用的研究。同时，这也是少有的几个通过16S rRNA测序的方法介绍了胆总管结石患者胆道微生物代谢特征的研究之一，本研究也通过对胆道与十二指肠微生物进行结构与功能预测而验证了胆总管结石患者存在细菌性十二指肠胆汁反流的假说。我们研究的一个重要局限性是16S rRNA扩增子数据集的样本量过小。因此，需要更大样本量的设计更合理的研究来验证我们的结论。本研究的另一个局限是缺乏来自健康个体的样本作为对照。然而，由于伦理原因，从健康个体获得胆管的胆汁或十二指肠样本是困难的。尽管健康人的胆汁和十二指肠液序列数据可从国家生物技术信息中心数据库获得，但是考虑到饮食与种族等因素，从中国患者中获取样本更合理。综上所述，本研究证实了胆道细菌对胆总管结石患者临床状况的预测价值，并对胆总管结石患者胆道和十二指肠微生物群的组成和功能特征提供了新的见解。胆道与十二指肠微生物之间的相似性支持了细菌性十二指肠胆汁反流理论是胆总管结石发病的病例机制。同时，当无法获得胆汁样本时，十二指肠液是进行细菌培养和药敏试验的很好的替代物。胆道微生物群的功能是一个有待探索的巨大宝库。本研究的发现为今后研究与疾病相关的胆道微生物群提供了一个重要的框架。对于所推断出的内容，需要在更大样本量的功能性实验研究的基础上进一步研究。
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