Pannexin1在慢性神经病理性疼痛中的作用研究进展

南京大学医学院附属鼓楼医院麻醉科 210008

国家自然科学基金（81701102）

【综述】

神经病理性疼痛（neuropathic pain, NP）是由于躯体感觉神经系统损伤或者疾病而直接导致的疼痛 ，主要表现为自发性疼痛、痛觉过敏、异常疼痛和感觉异常等。外周神经损伤、糖尿病、感染、自身免疫性疾病及某些化疗药物等均能引起NP 。受损的神经末梢释放多种兴奋性神经递质，包括谷氨酸、ATP、P物质、降钙素相关肽、脑源性神经营养因子等，这些神经递质进一步激活神经元以及突触周围神经胶质细胞内的抗N‑甲基‑D‑天冬氨酸受体（N‑methyl‑D‑aspartate receptor, NMDAR）、嘌呤受体、神经肽受体、降钙素受体样受体和酪氨酸激酶受体B，引起脊髓的可塑性改变，这是持续性疼痛、痛觉超敏和中枢敏化的基础 。非甾体抗炎药和阿片类药物对NP疗效不佳，这不仅严重降低患者的生活质量，也直接或间接地给患者家庭和社会造成高昂的经济负担。慢性NP是一个尚未解决的重大健康问题，全世界数亿患者需要新的治疗方法。

Pannexin 1（Panx 1）是一种与缝隙连接相关的大孔膜通道，对ATP具有很高的通透性，广泛表达于哺乳动物各种组织细胞中 。2014年，Bravo等 在大鼠坐骨神经损伤疼痛模型上，首次发现脊髓内表达的Panx1对慢性NP的发生、发展起着重要作用，之后在多种动物疼痛模型上又相继发现，感觉神经节及外周免疫细胞中表达的Panx1在NP中也起着关键作用 。鉴于Panx1通道对慢性NP发生、发展机制的研究意义以及新药研制的现实应用意义，本文对Panx1通道的分子细胞学基础及其与慢性NP相关研究成果进行综述。

1.1　Panx1的结构、分布与表达

Panchin等 于2000年在节肢动物、线虫、鸡、老鼠和人类等多种物种中克隆出与无脊椎动物Innexins通道蛋白基因同源（约20%）的基因序列，该蛋白序列在脊椎动物界广泛分布，故Panchin等 建议将其命名为Pannexins。该蛋白有3种亚型，分别为Panx1、Panx2和Panx3，它们有着不同的结构和功能。Panx1蛋白的拓扑结构与Connexins缝隙连接蛋白结构大体相似，有4个跨膜区域、2个胞外环、1个胞内环、1个胞质内N‑末端和1个胞质内C‑末端的六聚体 。特殊的是第2个胞外环中半胱氨酸254处的N‑糖基化位点，在蛋白转运至细胞膜的过程中起一定作用，避免了该通道与另一个细胞上的Panx1结合形成类似于Connexins的细胞间缝隙连接，因此Panx1通道是一种质膜通道。

Panx1在人体分布广泛，存在于大多数类型的组织和细胞中，如神经系统、消化系统、骨骼肌、心脏和皮肤等。在神经系统中，Panx1主要表达于中枢神经系统中的小脑、皮质、丘脑、视网膜、海马、嗅球、杏仁核、脊髓等部位的神经元、小胶质细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞及外周神经系统中感觉神经节内的感觉神经元及卫星胶质细胞 。

1.2　Panx1的激活与内化

Panx1是一种非选择性离子通道。不同的刺激形式会诱发Panx1通道产生不同的构象，表现出不同的特性 。通过单一膜电压刺激引起膜除极激活的Panx1通道会产生一个低电导（约50 pS/m）构象，具有高度特异的Cl−选择性，无阳离子通透性，且对ATP没有通透作用。相反，通过已知的某些刺激形式激活Panx1通道，Panx1可以过渡到一个“大孔隙”高电导状态（100~500 pS/m），能够介导非选择性阳离子电流，从而促进膜除极，亦表现出明显的ATP释放功能 。有研究表明，Panx1的非选择性高电导构象的激活是释放ATP等代谢物所必需的条件 。这些已知的能激活Panx1通道释放ATP的刺激形式主要有：机械刺激、细胞外K+浓度增加、细胞内Ca2+浓度增加、Src家族激酶（一组细胞内的非受体酪氨酸激酶）、羧基末端裂解以及NMDAR、P2X7受体（P2X7 receptor, P2X7R）和G蛋白耦联受体（G protein‑coupled receptor, GPCR）等的激活 。

2014年，Boyce等 在研究神经前体细胞和神经元中Panx1的过程中，发现胞外ATP升高诱导了Panx1内化。进一步研究后他们发现，胞外ATP的增加导致P2X7R‑Panx1在细胞周边形成团簇，随后内化 。此过程中P2X7R激活是P2X7R‑Panx1聚集成簇的关键，这与细胞内信号通路无关，但具有胆固醇依赖性。这些对ATP依赖的Panx1内吞作用新机制的发现，为P2X7R和Panx1的转运及它们之间的相互作用提出了新的问题。

Panx1在神经系统中表达丰富，包括神经元、神经胶质细胞和免疫细胞等。在促炎信号参与疼痛中枢敏化过程中，Panx1介导的ATP信号转导对脊髓背角和感觉神经节的神经胶质细胞的活化和增殖起着关键作用，随后释放的促炎分子通过增强脊髓背角Ⅰ、Ⅱ板层内二级感觉神经元的伤害性信号的转导，从而建立慢性疼痛表型 。

2.1　脊髓背角中的Panx1介导中枢敏化

脊髓内的促炎信号在建立疼痛中枢敏化中起着突出的作用，同时ATP是脊髓背角中急性和慢性疼痛信号转导的一个关键分子，Panx1既能通过与P2X7R的相互作用对ATP作出反应，又能作为脊髓内胶质细胞和神经元中ATP释放的通道。此外，P2X7R‑Panx1复合物是炎症体激活和IL‑1β释放所必需的 。Bravo等 在大鼠坐骨神经疼痛模型上通过鞘内注射Probenecid或Carbenoxolone（Panx1阻滞剂）瞬间降低周围神经损伤后的疼痛敏感度，首次证明此种现象。Di Cesare Mannelli等 在奥沙利铂诱导的NP模型中，鞘内注射Ertioglaucine或10Panx（Panx1阻滞剂）也可减轻疼痛敏化。因此表明脊髓背角Panx1通道可能是持续性疼痛中产生中枢敏化的关键因素。

2.2　感觉神经节内Panx1参与神经胶质/神经元间相互作用

在周围神经系统，Panx1表达于感觉神经节生长发育的各个阶段 ，在调节神经元的形态和轴突生长中扮演着重要的角色 。研究发现，在NP模型中，周围神经损伤后，Panx1在背根神经节中的表达（mRNA和蛋白）明显增加，背根神经节内神经元ATP释放增加，通过激活卫星胶质细胞P2X7R，刺激促炎分子的分泌，这种分子反馈到感觉神经元上，增强了神经元的活性 。这与敲除Panx1基因或用化学方法减弱Panx1表达后损伤性机械性超敏反应的阈值增高相一致 。在面部异常疼痛模型中，三叉神经节内神经元和卫星胶质细胞中Panx1的转录表达上调，Panx1依赖性的ATP释放增加 。在该模型中，用Mefloquine（Panx1阻滞剂）阻断Panx1通道可改善痛觉过敏，使用Cre重组酶条件敲除胶质纤维酸性蛋白阳性的胶质细胞中的Panx1，可立即消除痛觉过敏。另一方面，从神经元中条件敲除Panx1，可使疼痛阈值正常化延迟至两周后。这项研究表明，神经元和胶质纤维酸性蛋白阳性的胶质细胞中Panx1的表达都参与了痛觉异常的产生。然而，这些特定的基因敲除模型并没有区分Panx1活性在感觉神经节内（即初级感觉神经元和卫星胶质细胞）和脊髓及脑干内的信号（即二级感觉神经元和星形胶质细胞）的作用。

2.3　外周免疫细胞内Panx1介导中枢敏化和慢性NP

研究发现，在慢性疼痛模型中删除单核细胞和CD4+T细胞都能减轻疼痛的发展 。Weaver等 基于小鼠坐骨神经损伤模型的一项研究发现，外周免疫细胞（即单核细胞、T细胞和B细胞）中Panx1的活性对促进NP发生发展起关键作用。他们还发现重组仅表达WT‑Panx1的造血干细胞可以重建痛觉超敏反应，但重组先前已被证明对GPCR（如α1肾上腺素能受体）的激活具有抗性的表达突变体Panx1（Panx1Y198A）的造血干细胞，并没有表现出痛觉超敏反应，这说明GPCR信号是激活Panx1的必要条件 。然而Weaver等 通过CX3Cr1‑Cre Panx1KO和LysM‑Cre Panx1KO条件敲除小鼠免疫细胞中的Panx1，却未能预防NP。这些免疫细胞特异性基因敲除实验与造血干细胞Panx1重建实验之间的差异原因，研究者们推测为免疫细胞群体中Panx1的残留表达、Panx1条件丢失的功能补偿以及和Panx1在不同免疫细胞群体中的功能冗余等。

2.4　Panx1与NP相关的信号转导通路

2.4.1　ATP‑P2X7R‑Ca2+/Src‑Panx1

目前研究发现，神经系统中Panx1与P2X7R之间的相互作用主要发生在神经胶质细胞（卫星胶质细胞和星形胶质细胞）。Panx1通过增强胶质细胞P2X7R的活性参与NP的维持。当神经元受到刺激激活后，囊泡化的ATP释放，从而激活胶质细胞P2X7R。P2X7R激活后Ca2+内流并触发内质网Ca2+释放，胞内Ca2+浓度升高，或通过Src间接激活Panx1通道，这个通道释放更多的ATP，导致P2X7R的快速和可逆地开放，从而触发一系列细胞反应，如激活半胱氨酸蛋白水解酶‑1和释放IL‑1β等 ，以此介导慢性NP的中枢敏化。

2.4.2　谷氨酸‑NMDAR‑Src‑Panx1

在神经系统中，Panx1与NMDAR之间的相互作用主要发生在神经元细胞。NMDAR是广泛表达于中枢神经系统的配体依赖型受体，在介导慢性NP中枢敏化的始动过程中起着重要作用。在NMDAR‑Src‑Panx1这条通路上，突触前膜除极导致囊泡性谷氨酸释放，激活突触后膜上的NMDA受体引起Ca2+内流的同时，NMDAR与胞内Src激酶相互作用后，Src激酶使Panx1在羧基末端的Tyr‑308残基处磷酸化，激活Panx1通道，进而引起突触后神经元大量Ca2+内流，从而起到一个放大器作用 。

目前已知Panx1与NMDAR、P2X7R在神经系统中的相互作用，但这种相互作用在慢性NP中的存在尚不完全清楚。但可以确定的是，Panx1在神经损伤后NP的发展和维持中起着重要作用，这可能是开发非麻醉药物治疗慢性NP的新靶点。