新晋诺奖得主最新Cell论文：程亦凡/David Julius合作揭示痛觉感受器TRPV1如何感知多种自然界的刺激物

结构生物学被熟知从分子层面的细节去帮助理解宏观现象的发生发展机制，尤其得益于单颗粒冷冻电镜技术的日趋成熟和广泛应用。随着 AlphaFold2 在蛋白结构预测的骄人战绩，结构生物学的研究方向和未来被热烈讨论。不可否认，蛋白预测会从现有和潜在的其他角度促进科学研究，而基于实验数据的结构生物学需从更创新和更深刻的角度解答科学问题。 2021年9月7日，美国加州大学旧金山分校 程亦凡 实验室和 David Julius 实验室在 Cell 发表了题为： Structural snapshots of TRPV1 reveal mechanism of polymodal functionality 的研究论文。 该研究在施加不同天然刺激物和模拟不同生理环境的条件下， 借助于单颗粒冷冻电镜技术分别解析了辣椒素受体TRPV1一系列的中间态构象和激活机制 ，观察到多种关闭和开放状态，揭示了与多重配体作用位点偶联相关的结构元件，比较了不同大小阳离子通过时的蛋白行为，探讨了激动剂与内源脂类分子竞争结合位点的计量关系，同时也描述了酸条件下的蛋白构象重排。 该研究的共同通讯作者David Julius教授刚 刚凭借对辣椒素受体TRPV1的研究荣获本年度的诺贝尔生理学或医学奖。 TPRV1属于四聚体形式的离子通道，非特异性传输阳离子，与疼痛和炎症产生密切相关，能被多种天然存在的刺激物和细胞外酸度激活。TPRV1的天然刺激物包括辣椒的活性成分辣椒素 （Capsaicin） 、毒蜘蛛产生的多肽毒素 （DkTx） 、从树脂大戟分离的树胶脂毒素 （RTX） ，同时也能感知温度变化 （>43°C） 从而参与生物体的体温调节。正因为TPRV1介导信号传递的重要性，它成为了颇具临床意义的潜在镇痛靶点。但又因为其信号整合的复杂性，靶向TPRV1的镇痛剂研发和应用依然存在损害体温调节等副作用。因此，在不同刺激物作用下，TRPV1激活通路的多样性、独特性和共同性探究显得十分必要，并有望为靶向TPRV1的药物研发提供更深刻和有针对性的指导。 作者将蛋白TPRV1重组到脂质环境，从体外表达和纯化了多肽毒素DkTx，并制备了二者复合物的冷冻样品。通过优化样品制备条件和数据处理参数，作者成功鉴定了从预结合、单结合、双结合时通道关闭和开放的一系列中间态结构。这些递进的构象变化，特别是S1-S4 结构域从初步到充分的构象外移，有力地解释了结合在胞外侧的多肽类激动剂DkTx如何偶联并触发TPRV1的低位门控开放。 与DkTx结合位点不同的是，香草酸类激动剂RTX结合到TPRV1的低位门控所在区域，从而直接调节低位门控的开放状态。在无配体结合状态下，TPRV1香草酸类激动剂结合位点由内源性脂类分子PI占据。这意味着RTX对TPRV1的激活需要首先竞争性替换掉结合口袋内的PI，然后才发挥对离子通道的调控作用。在低盐条件下，作者成功地揭示了RTX分子与PI竞争四个结合口袋的各种可能性，分别是单一RTX分子、双分子邻位和对位、三个和四个RTX分子结合。RTX分子每完成一个结合口袋的竞争都会引起对应的亚基构象变化，但直到四个亚基都被RTX所占并引起足够的构象变化时，TPRV1的门控开放才得以呈现。   生物体局部组织的酸聚集也能开启TPRV1的信号传导。过去的功能性实验证明TRPV1胞外侧的两个氨基酸构成对酸响应的关键位点。基于解析的多个中间态构象，作者直接观察到了这两个氨基酸位点是如何在酸条件下发生局部结构性变化并逐步影响TPRV1的构象。虽然这些中间态并非处于完全开放状态，但类似于DkTx作用时的S1-S4 结构域构象变化诠释了酸环境对TPRV1开放的促进作用。 作者进一步探究了TPRV1对大型阳离子 （例如NMDG） 的传输机制。通过在溶液中添加大型阳离子并制备冷冻样品，作者解析了TPRV1多个构象。这些构象覆盖了NMDG是如何引起胞外侧的孔区扩张，并逐步进入离子传输路径。这些发现证实了TPRV1胞外侧对不同生理环境的适应性，以及如何介导不同大小离子跨膜传输的作用机制。 加州大学旧金山分校博士后张凯华博士为该论文的第一作者，加州大学旧金山分校生物化学和生物物理系程亦凡教授和生理系David Julius教授为共同通讯作者。 David Julius 实验室在1997年发现了TRPV1，证实这是一个可以被热和辣椒素激活从而引起痛感的离子通道。程亦凡实验室则一直从事冷冻电镜的方法和应用的研究。这俩个实验室有着长期的合作，曾经在2013年利用单颗粒冷冻电镜方法第一次解析了TRPV1的原子结构，并引发了一场结构生物学的变革。 2016年，张凯华博士加入这个合作团队从事博士后研究。他成功地应用了单颗粒冷冻电镜技术在分析样品异质性所具有的优势，通过对中间态结构的研究来进一步解释TRPV1结构和功能之间的关联，并从生物学角度诠释了解析蛋白机器中间态结构的重要性。这些发现将有助于更加深刻地理解TRP 家族离子通道，甚至是其他信号传导蛋白的功能，并为靶向TRPV1的药物研发提供新思路。就结构生物学而言，特别是在利用人工智能进行结构预测取得重大进展的背景下，利用单颗粒冷冻电镜来捕捉中间态结构以解释蛋白的功能也许会是今后一段时间的一个新的研究方向。  

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