科研 | 浙江大学：淹水条件下沿“炭际”梯度变化下的细菌群落结构和氮循环功能特征（国人佳作）

各处理N₂O排放量随时间而减少（图1C）。3种生物炭处理在28天后均无N₂O排放，而对照组的N₂O排放持续到49天。原状生物炭在第7天和第14天的N₂O排放显著低于对照组、酸改性生物炭和水洗生物炭处理。与对照组、酸改性生物炭和水洗生物炭处理相比，原状生物炭处理在2 mm区域的脲酶活性显著增加（p < 0.05，图1D，表S1）。在第7天和第14天，原状生物炭处理在2 mm区域的脲酶活性分别比10 mm区域高4.2倍和2.9倍。在第7天时，2 mm区域脲酶活性达到峰值（38 mmol N kg⁻¹ d⁻¹）。

随着时间的推移，所有生物炭处理以及对照的α-多样性均显著增加（图2A和S4）。7天时，6、10和> 10 mm区域的Chao1和Shannon指数无统计学差异，而在2 mm区域，水洗生物炭处理α-多样性最高，其次是酸改性生物炭、对照组和原始生物炭。在第70天，Shannon指数随着与酸改性和水洗生物炭源的距离增加而降低，但在原状生物炭处理中没有发现差异。

PERMANOVA单独和联合分析了细菌群落在生物炭类型、培养时间和不同炭际区域的变化（表S2）。培养时间解释变异的最大部分（39.7%，p < 0.001），其次是离生物炭源的距离（14.1%，p < 0.001）和生物炭类型（12.1%，p < 0.001）。此外，Mantel检验表明，土壤参数显著影响细菌群落结构，包括pH（p < 0.01）、DOC（p < 0.01）、DON（p < 0.01）、NH₄⁺（p < 0.01）、NO₃⁻（p < 0.01）和N₂O排放（p < 0.05）（表1）。NMDS表明，在7 ~ 70天的细菌群落在第一主坐标上有明显的分离（图2B）。生物炭类型和取样区域也对变异有贡献，特别是在第7天时。随着时间的推移，距离效应的变化减弱，原状生物炭处理与其他生物炭处理明显分开。

图2. 细菌α多样性（以Shannon-Wiener指数表示）（A）和经过7天和70天的培养后，在对照组、原状生物炭、酸改性生物炭和水洗生物炭处理中，不同炭际区域的细菌群落组成基于Bray-Curtis矩阵非度量多维标度排序图（NMDS）（B）。（原文图3）

与7天时的细菌群落组成相比，在70天时，1482个OTUs（p < 0.05 ）相对丰度增加，560个OTUs（p < 0.05）相对丰度降低（图3A）。原状生物炭处理中显著富集的OTUs数量最高（265），其次是水洗生物炭处理（80）和酸改性生物炭处理（18）（图3C）。此外，与对照相比，原状生物炭处理富集了554个OTUs（p < 0.05），减少了552个OTUs（p < 0.05）（图3B）。差异丰度分析检验了生物炭源的距离对OTUs的影响（图4A）。结果发现，与10 mm区域相比，原状生物炭处理在第70天显著增加了2 mm区域的236个OTUs的丰度，其中属于变形菌门、厚壁菌门和放线菌门丰度最高，而减少的118个OTUs以厚壁菌门为主。

LEfSe分析（Linear discriminant analysis Effect Size）从门到属水平确定了生物炭源的距离对特定细菌类群的影响。结果发现，在2、6、10和> 10 mm区域分别富集了88、16、6和27个支系（图4B）。在纲水平上，2 mm区域Melainabacteria、AD3和Negativicutes丰富度显著增加，6 mm区域Cyanobacteria、10 mm区域Coriobacteriia丰富度显著增加，> 10 mm区域Ignavibacteria和Latescibacteria丰富度显著增加。

图4. （A）通过差异丰度分析，原状生物炭处理在70天时，在2 mm和10 mm区域的细菌OTUs的富集和减少。每个点代表一个OUT，虚线表示增加/减少2倍，数字表示差异OTUs的数量。（B）LEfSe分析的进化分支图表示了原状生物炭处理在70天时，不同炭际区域的差异分类群。分类群进化分支图中相应节点根据该分类单元的最高排名组进行颜色编码。黄色节点是指在炭际区域之间没有显著差异的物种。分支图的六个环代表界（最内层）、门、纲、目、科和属水平。（原文图5）

我们的研究结果表明，培养时间、与生物炭源的距离和生物炭类型对土壤细菌组成有显著影响（表S2）。但值得注意的是，与之前的几项研究结果相反，相比于对照组，尽管原状生物炭处理的pH值和DOC浓度较高，但其Chao1和Shannon指数并没有增加（图2）。这表明了，与对照组相比，原状生物炭并没有增加细菌群落的丰富度和均匀度。这种意想不到的结果可能归因于“不平衡竞争”——生物炭的添加促进了较为敏感的细菌类群的生长，反过来又抑制了其他物种的生长。OTUs的差异分析进一步证明了原状生物炭对细菌组成的选择性影响（图3B）。相比于对照，原状生物炭处理中富集OTUs的数量（554）与减少的OTUs数量（552）相近。因此，原状生物炭处理中的细菌群落结构会显示出与对照、酸改性和水洗生物炭处理更为显著的差异（图2B）。这表明原状生物炭的选择效应用是导致细菌群落结构组成特有化的关键因素。这与Zhang等人（2021）发现土壤热解有机质异质性是微生物组装的一个强有力的选择因素的结果一致。而酸改性和水洗生物炭处理显著提高了细菌群落的Chao1和Shannon指数，表明生物炭酸碱中和或有毒溶解化合物的去除缓解了原状生物炭对细菌的抑制作用。例如，毒性减轻可能是由于呋喃、多环芳香烃和二恶英等存在于生物炭上的有毒物质的浸出。这些研究结果表明，原状生物炭处理增加了特定细菌类群，同时抑制了其他类群。

原状生物炭对与生物炭源的距离对细菌群落α-多样性的影响不显著。这可能是由于原状生物炭的碱度和DOC浓度高于酸改性和水洗生物炭处理。在70天时，酸改性和水洗生物近炭际区域的pH值和DOC浓度高于远碳际区域。而原状生物炭的不同采样区之间没有显著差异（图S2-3）。与酸改性和洗涤的生物炭处理相比，在原状生物炭处理中，不稳定的营养物质和DOC在所有采样区域迅速扩散，导致细菌生存的环境相对均匀（pH和碳源）。与α-多样性相反，与其他采样区相比，在2 mm区域中响应的细菌种类更丰富（图4），表明原状生物炭在2 mm区域中更显著地改变了细菌群落的组成，但并没有影响整体的物种多样性，这也支持了“不平衡竞争”的概念。

在70天时，在原状生物炭处理的2 mm区域与10 mm区域相比，变形菌门的丰度通常更高，尽管α-多样性没有显示出很大的差异（图4A）。其他门的富集、减少的OTUs差异小于变形菌门。Dai等人（2016）发现，热解有机质为微生物群落提供了大量易矿化的碳，导致对营养输入高度敏感并消耗大量不稳定态的碳的变形菌门富集。同时，由于对尿素酶活性的更有利的pH条件，添加原状生物炭的处理在培养开始时，尿素快速水解，提供了大量的NH₄⁺。与原始生物炭处理相比，酸改性和水洗生物炭处理的脲酶活性较低（图1）验证了这一发现，这是因为酸改性和水洗生物炭处理中的pH较低（图S2）。而较高的NH₄⁺浓度是变形菌门丰度增加的原因之一。氮素的增加使得与氮循环相关的功能类群有效地胜过其他类群。多种变形菌参与了氮循环过程，在原状生物炭处理的2 mm区域内，变形菌门的丰度增加，进一步改变了土壤细菌的功能。

与氮循环相关的物种丰富度，主要为变形菌门，在2 mm和10 mm区域中更高（图5，表S4）。变形菌门对氮浓度高度敏感，并且是在硝化、反硝化和N₂固定中发挥作用的最主要细菌类群。Dai等人的研究表明，与土壤pH值相比，增加有机碳和养分的供应在决定变形菌的丰度和组成方面更为重要。尽管原状生物炭处理与对照相比减少了一些参与氮循环的细菌类群（图5A），但相对于原状生物炭处理的10 mm区域，许多特定的属在2 mm区域中富集（图5B - D）。因此，氮循环功能类群分布的空间变化随着不同炭际区域的变化而改变了氮循环过程。MND1属于亚硝化单胞菌科，代表着包含氨氧化细菌的分类群在2 mm区域富集。在原状生物炭处理中，负责NO₂⁻氧化的硝化螺旋菌属和Nitrolancea属的相对丰富度下降，但在2 mm和10 mm区域之间没有任何差异。此外，完整的硝化过程（NH₄⁺ →NO₂⁻ → NO₃⁻）可以由某些属于硝化螺旋菌属的物种完成，这使得硝化螺旋菌属成为构成氮循环细菌群落的关键组成部分。Han等人（2017）的研究发现，生物炭降低了连作土壤中硝化螺旋菌属的相对丰富度。硝化螺旋菌属和Nitrolancea属的丰度较低表明原状生物炭降低了土壤的硝化潜力。此外，在原状生物炭处理过程中，结合较高的脲酶活性和NH₄⁺浓度以及较低的NO₃⁻浓度现象相结合，表明原始生物炭减少了NH₄⁺向NO₃⁻的氧化过程（图1）。