科研 | Nature子刊：利用成像和分子方法研究海洋固氮物的全球分布模式

编译：微科盟鼻涕，编辑：微科盟茗溪、江舜尧。

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我们首先使用机器学习工具（见“方法”）在塔拉海洋（Tara Oceans） 高通量共聚焦成像数据集中搜索固氮菌，该数据集源自在 48 个不同采样位置收集的 20-180 μm 大小的浮游生物的 61 个样本（补充图S2）。我们共预测了 400 多幅硅藻-固氮组合（diatom-diazotroph associations; DDAs）图像和近 600 幅束毛藻属（Trichodesmium）游离菌丝的图像（图1和2；https://www.ebi.ac.uk/biostudies/studies/S-BSST529）；与分子分析一致（见后文），所有图像均来自热带和亚热带地区。接着，我们对来自51个站点的75个样品中大小为5-20 μm的共聚焦显微镜图像进行了相同的图像识别搜索，共检测到8张短束毛藻属（Trichodesmium）菌丝和4个单半管藻属-植生藻属（Hemiaulus-Richelia）共生细胞的图像。因此，我们的观察结果与早期的研究结果一致，即在取样过程中，大多数菌丝是根据其长度而不是直径收集的。

我们确定了以前未在固氮数据库中报道的几个新位置（见下文；图3，补充图S3和S4）。此外，我们还在报道较少的硅藻梯形藻属（Climacodium）中发现了类鳄球藻（Crocosphaera-like）细胞和其他细胞的菌落。值得注意的是，通过546频道发出的强烈藻红素信号，可以检测到少量的鳄球藻（Crocosphaera）细胞（1-2个细胞），而每个梯形藻属（Climacodium）宿主的鳄球藻细胞和叶绿体都在红色频道（638 nm）上发出自身荧光信号，通过图像识别模型来证明信号的组合是检测不明显浮游生物的关键属性（图1）。

基于3个主要硅藻-固氮组合（DDAs）图像分析的丰度范围：半管藻属-植生藻属（Hemiaulus-Richelia），根管藻属-植生藻属（Rhizosolenia-Richelia）和角毛藻-眉藻属（Chaetoceros-Calothrix）是较低的并且代表着密度背景值（如1.5–20 共生细胞 /升）（图3和补充图S3a）。考虑到样品处理中使用的 180 μm 筛子，低密度和检测，尤其是可以形成长链（> 50 个细胞/链）的角毛藻-眉藻属（Chaetoceros-Calothrix）和更大的根管藻属-植生藻属（Rhizosolenia-Richelia）共生体并不奇怪。虽然半管藻属-植生藻属（Hemiaulus-Richelia）是最常被检测到的，但它的链通常很短（1-2个细胞），有时细胞的完整性会受到损害（例如破坏细胞膜；弱自发荧光）。与之前的观察一致，共生丝（毛状体）的数量和长度的变化也被观察到，并取决于与哪个宿主有关的植生藻属/眉藻属（Richelia/Calothrix）（图2）。此外，还发现了在文献中较少见的游离植生藻属（Richelia）和眉藻属（Calothrix）细丝，对于兼性共生体来说这并不意外。

硅藻-固氮组合（DDAs）和植生藻属/眉藻属（Richelia/Calothrix）菌丝广泛分布，并在几个新的位置被检测到，包括印度洋（IO），北大西洋（SAO），南太平洋（SPO）环流以及太平洋旁边的巴拿马运河（补充图S3和S5）。除了两个较深的半管藻属-植生藻属（Hemiaulus-Richelia）样品外，硅藻-固氮组合（DDAs）集中在表面，并且表面密度较高。两个例外是来自夏威夷海洋时间序列站ALOHA的108米深度的样本（一个长期的贫营养生境评估；TARA_131；北太平洋亚热带环流）和38米深的TARA_143样本（墨西哥湾流，北大西洋）（图3b）。在ALOHA观测站，通过在光带以下的系泊沉淀池中观察到的硅藻-固氮组合（DDAs）的季节性开花是众所周知的。然而，在墨西哥湾流中观察到共生硅藻更为罕见。

我们观察到密度为1-40束毛藻属（Trichodesmium）游离菌丝/升。与硅藻-固氮组合（DDAs）相似，由于采集和处理的原因，束毛藻属（Trichodesmium）的长游离菌丝可能取样不足（其中，长度>180 μm的占35%）。束毛藻属（Trichodesmium）的游离菌丝与硅藻-固氮组合（DDAs）在印度洋（IO）和北太平洋（NPO）的大多数位置共现（图3a和补充图S4），它们也在未检测到硅藻-固氮组合（DDAs）的地方被观察到，比如在太平洋北赤道洋流（TARA_136）。几十到几百束毛藻属（Trichodesmium）菌丝通常聚集成梭形的菌落被称为“tufts” 或“rafts”，或圆形的菌落被称为“puffs”（从200 μm到5 mm）（图1）。这些尺寸可以通过UVP5原位成像检测和量化（图3和补充图S4a），共有220张图像清晰地描绘成簇状或蓬松的菌落，长轴为1-10 mm，短轴为0.4-4 mm（(https://www.ebi.ac.uk/biostudies/studies/SBSST529）。严格的物种注释可能低估了束毛藻属（Trichodesmium）菌落的丰度（见下文与宏基因组的相关性）。菌落密度在南大西洋（SAO）和南太平洋（NPO）中更普遍，而游离菌丝密度在印度洋（IO）中更丰富（图3a和补充图S4a），可能与营养限制下增强束毛藻属（Trichodesmium）的菌落形成有关（补充图S6），并且证实了培养实验中观察到的趋势。

自养的单细胞无藻固氮菌（noncyanobacterial diazotrophs；NCDs） 是通过将自养细菌密度的流式细胞术估计值与从 0.22-1.6/3 μm 大小的浮游生物宏基因组测序得出的固氮菌相对丰度相结合来估计（见“方法”）。与最近基于宏基因组组装基因组重建的报道一致，我们检测到浓度高达2.8 × 10⁶个细胞每升，其中，浓度最高值在太平洋（图3a）。

结合来自塔拉海洋（Tara Oceans）的成像数据集（流式细胞术，共聚焦显微镜和 UVP5），能够将丰度转换为无藻固氮菌（NCDs）、束毛藻属（Trichodesmium）和硅藻-固氮组合（DDAs）的生物量估计值（图3c）。单细胞自由生活的非传染性疾病是迄今为止表层海洋中最丰富的固氮菌，然而，就生物量而言，束毛藻属（Trichodesmium）在非传染性疾病中占主导地位，比非传染性疾病高出两个数量级（图3c）。非传染性疾病的细胞密度和生物量以前从未在全球尺度内报道过，因此，本文提出的工作扩展了我们对这些最近认识到的重要固氮菌的相对贡献的理解。

为了进一步了解整个浮游生物大小范围内固氮菌的丰度和分布，我们将成像数据与 5 个主要大小的宏基因组读数进行了比较，这些数据与 29,609 个独特 nifH 序列的综合目录相对应（见“方法”）。nifH目录代表了固氮菌分离株和环境克隆库的大部分遗传多样性（尽管它有一些冗余；见“方法”），其中30%的序列来自海洋环境，其余来自陆地和淡水生境。大约2.5%的nifH序列（29,609个序列中的762个）至少被定位了与1164个宏基因组的相似性为80%，共检索到96,215比对上的读长（mapped reads）。在762个序列中，167个检索到的序列只有一个读长（reads）。在多于一半的样本中检测到了比对上的nifH 读长（1164个宏基因组中的66%或771个），这突出了塔拉地区中固氮菌的广泛分布海洋数据集（图4a中蓝色圆圈代表地表水；补充数据1）。

用nifH/recA的序列丰度比值来估算固氮菌的相对贡献（见“方法”）。我们的分析显示了固氮菌丰度的急剧增加（多达4个数量级）和向较大尺寸的浮游生物类别的组成转移（图5）。例如，固氮菌只占0.22-1.6/3 μm粒径（0.004-0.8%）的细菌群落的一小部分，然而，在180-2000 μm尺寸范围内，它们增加到0.003-40%（图5a）。这种增长与分类法的变化是一致的（图5b,c，补充数据1）：变形菌门（proteobacteria）和浮霉菌门（planctomycetes）是0.22-1.6/3 μm颗粒的主要组成部分（分别为0.004-0.08%和0.005-0.4%），而蓝藻固氮菌在较大体积组分中占主导地位，包括丝状（束毛藻属和其他）和非丝状（独立生存和共生）（分别为0.2-45%和0.2-2%）。在基于成像和宏基因组学方法的大型蓝藻固氮菌定量之间观察到显著的一致性（图6，补充图S3ab和S4ab）。因此，开发出了一个彼此能够相互通知的从图像到基因组学和基因组到图像的完全可逆的流程。图像分析使人们能够快速识别哪些平行宏基因组（或宏转录组）样本应该包含特定的固氮菌。对于像蓝藻固氮菌这样数量相对较少的种群，这种方法将减少遗传分析中的检索时间。

nifH数据库中大部分（95%）的读长（reads）对应于20个分类组：5株蓝藻菌（cyanobacteria），2株浮霉菌（planctomycetes）和13株变形菌（proteobacteria）。对于无藻固氮菌（NCDs），其中2种浮霉菌和13种变形菌体中的7种对应于最近的宏基因组组装（命名从HBD01到HBD09），在塔拉海洋（Tara Oceans）宏转录组中0.22–1.6/3 μm 大小的部分，它们是nifH转录本的主要贡献者之一。我们还发现这些类群有较大的体积分数（图5c和7）。0.8 μm孔径的过滤器使较大的细菌细胞富集，同时允许较小直径的细胞通过（包括更丰富的分类群：SAR11和原绿球藻）。然而，有趣的是，在三个最大尺寸部分（5-20、20-180 或 180-2000 μm）中检测到无藻固氮菌（NCDs），表明无藻固氮菌（NCDs）附着在颗粒（例如，海洋雪、粪便颗粒）和/或更大的真核细胞上/ 生物体，聚集成群落，或可能被原生生物、悬浮饲养者和/或桡足类动物捕食。

蓝藻细菌的主要类群是束毛藻属（Trichodesmium），植生藻属/眉藻属（Richelia/Calothrix）和单细胞蓝藻（UCYNs）（UCYN-A1，UCYN-A2，和鳄球藻）。束毛藻属（Trichodesmium）代表了所有固氮菌中nifH基因最高数量的读长，并且在三个最大尺寸的片段中构成高达 40% 的细菌群落（图5c和7）。植生藻属（Richelia）nifH 读长也主要在 5-20、20-180 和 180-2000 μm 中检测到，而眉藻属（Calothrix）仅限于 20-180 μm。两个观察结果都与植生藻属/眉藻属（Richelia/Calothrix）和大小硅藻的预期关联一致（半管藻属Hemiaulus，根管藻属Rhizosolenia，角毛藻属Chaetoceros）（图1，2，5c和7），偶尔有游离菌丝的报道。在共聚焦分析中也检测到游离的菌丝（补充图S5；https://www.ebi.ac.uk/biostudies/studies/S-BSST529）。UCYN-A1 的相对丰度在较小的尺寸片段 0.2-1.6/3 μm 和 0.8-5 μm 中最高，与预期的宿主细胞大小（1-3 μm）一致。然而， UCYN-Al也在较大颗粒（5-20、20-180和180-2000 μm）中被检测到（图5c和7），这表明UCYN-A受到较大颗粒的侵蚀和/或与较大颗粒（如海洋雪或聚集物）有关，这些颗粒随后可能沉入深海（见下一节）。此外，由于生活方式的多样性，鳄球藻（Crocosphaera）还具有多个大小组分（0.8-5，5-20，20-80和180-2000 μm）：自养，定殖以及与大的气候藻硅藻共生（图1）。

nifH序列与一些淡水rhopalodiacean硅藻的“椭球体”（补充图S7a）高度相似，被招募到 20-180 μm 尺寸片段的地表水中（图5c和7）。这些观测结果在多个海洋盆地中都有记录（印度洋，北太平洋，和大西洋；补充图S7b）。“球体”的基因组分析表明光合作用和其他自养蓝藻常见的代谢途径丧失，它们被认为对各自的宿主有约束力。因此，我们不期望它们出现在较小的片段中。据我们所知，这是这些种群在海洋水域存在的第一个基因证据。然而，这些类群检测水平很低（约占浮游细菌总数的0.5%）（图5c和7），与预期的硅藻宿主细胞直径一致（30-40 μm）。利用发表的共生rhopalodiacean硅藻图片，我们在感兴趣的样本中手工选取相似的图像作为训练集（补充图S7c）。然而，这种预测是初步的，需要通过本研究之外的其他方法进一步验证，以验证它们是否确实是固氮共生生物。

固氮菌丰度受纬度影响，显示热带和亚热带地区的预期相对丰度较高，而赤道的丰度减少，预计上升流和溶解的养分较高（图4）。这种模式与数十年的实地观察（例如 NAO、NPO），建模工作以及在塔拉海洋（Tara Oceans）期间测量的环境和物理化学变量的相关性分析一致（图8）。温度和养分有效性是控制固氮丰度的常见因素。由于固氮酶对铁的需求量很高，预计铁也很重要，因此意外地发现固氮丰度与模拟的溶解铁浓度之间的关系不太稳健（图8a）。然而，我们不能忽视相对于原位生物可利用 Fe 浓度的建模值的不准确性。

我们进一步分析了更深深度样本中的丰度和分布模式（分别为 0–200 m 和 200–1000 m）。在宏基因组和成像数据集中，与深层叶绿素最大值（DCM；17-188 m）相比，在表面（5 m）检测到的N₂固定蓝藻数量更多，证实了预期的分布（图3b和8c，也比较图9和补充图S8）。然而，尽管如此，在来自不同地区的一些叶绿素浓度最大值（DCM）样品中检测到束毛藻属（Trichodesmium）和 DDA 共生体仍然很重要：印度洋（IO），北太平洋（SPO）和红海（RS）（补充图S8）。考虑到报道的快速下沉率和在系泊沉积物圈闭中的观察结果，硅藻-固氮组合（DDAs）被深度估计（ALOHA站点）。传统上一直认为束毛藻属（Trichodesmium）的出口能力较差，但最近有相反的报道，因此束毛藻属（Trichodesmium）也有望在深度被报道。鳄球藻（Crocosphaera）丰度增加同时出现在印度洋（IO）样品的叶绿素浓度最大值（DCM）中，尺寸较大（5-20 μm）；表明了先前报道的鳄球藻（Crocosphaera）的定殖和/或共生生活方式（图1）。与光养固氮菌不同，无藻固氮菌（NCDs）的分布在上层没有明显的深度划分（图8c）。

在中层样本中检测到相对较多的 nifH 读长（128 个中层样本中的 110 个或 86%，补充图S9）。尽管之前已经深度报道了 BNF 和 nifH 表达，但大多数测量都是在氧气最低区（OMZ；发现低氧水域的地方）和缺氧区（ODZs；氧气浓度低到足以诱导厌氧代谢的地方）进行的。本研究从OMZs和ODZ之外的许多中层样本比对上的nifH序列，包括北太平洋（SPO），南太平洋（NPO），南大西洋（NAO）和北大西洋（SAO）（补充图S9）。大多数nifH序列对应于变形菌，然而，也检测到固氮蓝细菌（补充图S9）。特别是，北大西洋（SAO）中 TARA_78 中层样本中总nifH读长的 44% 和 TARA_76（0.2-3 μm 大小片段）的 6% 仅对应于 UCYN-A（补充图S9，补充数据1）。在这些站点的相应地表样本中检测到所有塔拉海洋（Tara Oceans）样本中 UCYN-A 读长的最大数量，表明存在地表水华（图9；见下文）。大多数报道表明 UCYN-A 在阳光照射区的存在和活动，但一项研究报道了大西洋东北部浅水沉积物中的 UCYN-A nifH序列（海底 38–76 米深）。我们在公海 800 m 深处对 UCYN-A 的观察表明，尽管细胞直径很小，但这种共生可能有助于碳输出，或者该海洋区域的其他物理过程（例如俯冲，下降流，上升流）正在影响 UCYN-A 在深处的高检测率。

几个区域显示出以前没有采样过的固氮菌的高密度或“热点”（图4和9，补充图S10）。例如，在马达加斯加（Madagascar）和非洲大陆（African continent）之间的莫桑比克海峡（Mozambique Channel），固氮菌占较大尺寸样品中浮游细菌的 30-40%（TARA_50，TARA_62；图4和9）。后者的分子结果由束毛藻属（Trichodesmium）和共生固氮菌的图像证实（图3a）。另一个例子是南美洲附近的北大西洋（SAO）（TARA_76、TARA_78 和 TARA_80），其中 UCYN-A 在 0.8-5 μm 大小的片段中达到了浮游细菌种群的 3-4%（图4和9）。来自印度洋（IO）和北大西洋（SAO）的这些区域代表了先前未对固氮菌进行采样的区域，这些区域也缺乏 BNF 的定量速率测量。

自养的单细胞非传染性疾病的最高丰度（0.2-3 μm）对应于赤道 PO 马克萨斯群岛之后浮游细菌的约 0.5%（TARA_123；图9）。该站最近被报道为由天然铁肥引发的地表浮游藻华。其他高密度区域对应于 SPO 中的几个站点（TARA_98 和 TARA_99 的表面样品以及 TARA_102 的 DCM），在这些站点中发现了高丰度的变形菌和浮游菌（分别为 4–33% 和 8–9%），可能是由于无藻固氮菌（NCDs）与下沉颗粒的关联所致，它们的尺寸较大（图9和补充图S8）。此外，TARA_102位于秘鲁的上升流区域，该区域先前报道了与 OMZ 相关的非传染性疾病和/或 BNF 活动，这些结果与最近来自亚热带太平洋的高度多样化无藻固氮菌（NCDs）的报道一致，其中一些与下沉粒子有关。因此，我们可以将可能与颗粒相关的无藻固氮菌（NCDs）的分布范围扩大到其他几个海洋盆地（南大西洋，大西洋，印度洋）。我们的研究结果强调了无藻固氮菌（NCDs）在表面和叶绿素浓度最大值（DCM）的较大尺寸片段中的主导地位和持久性，这是我们所知的新信息，值得进一步研究。

许多地区含有低丰度的固氮菌。例如，大西洋（AO），南大洋（SO）和地中海（MS）中固氮菌的百分比分别达到最大值，仅为 0.4%，1% 和 4%（图4c和9）。大西洋（AO）中最高的固氮丰度对应于在东西伯利亚海的浅水区（20-25 m 深）中发现的NCDs（TARA_191；图4c和9），这是一个生物学采样的区域。综合起来，这里报道的有关分布的结果强调了固氮菌的斑块状生物地理模式。

除了印度洋（IO）、红海（RS）、南太平洋（NPO）和南大西洋（NAO） 中的少数站点外，其中束毛藻属（Trichodesmium）是比对上读长的主要组成部分（图8b和9，补充图S11），多个海洋区域的几种蓝藻固氮菌存在普遍且一致的共存趋势（图9和补充图S11）。例如，在红海 (RS)，印度洋（IO）南部和 ALOHA 站点，检测到较大（Trichodesmium, Richelia）和较小（UCYN-A, Crocosphaera）直径的固氮菌（图9和补充图S11）。事实上，UCYN-A 尚未在 红海（RS）中报道，而其他所有蓝藻固氮菌之前都被报道过，包括束毛藻属菌株（Trichodesmium spp.）的表面水华。相反，只有小直径固氮菌在北大西洋（SAO）中共同占主导地位；例如，UCYN-A1和UCYN-A2在TARA_76，TARA_78和TARA_80位置非常丰富（图9和补充图S11）。对不同大小和生活方式（定殖的，自养的，共生的，粒子相关的）的混合固氮菌群大量和一致的观察突出了考虑这些特征如何其共生的必要性。

超小原核生物是不寻常的，因为它们的细胞体积减少（这些细胞可以通过 0.22 μm的过滤器，这个尺寸通常可以排除大多数微生物），因此它们被认为减少了基因组，缺乏进行更复杂代谢过程所需的蛋白质。然而，最近有研究表明它们确实参与了复杂的新陈代谢。为了检查它们是否也可能对海洋BNF有贡献，我们对来自不同水层的 <0.22 μm尺寸大小样品的 127 个宏基因组进行了分析。

我们的数据集中共有 79 个nifH序列与这些宏基因组具有至少80%的相似性，共检索了 43,161 个比对读长，其中大多数读长与变形菌nifH序列具有高度同一性。在79个序列中仅15个检索到一个读长，127个样本中92个（72%）检测到比对的nifH读长，这突显了超小固氮菌的意外广泛分布（图10a中的蓝色圆圈；补充数据1）。值得注意的是，当nifH读长通过recA读长归一化时，我们发现固氮菌占超小型浮游细菌的10%，在大西洋（AO）和不同水层中检测到的丰度最高（图10a,b）。考虑到在大西洋（AO）中检测到其他尺寸部分中固氮菌丰度最低，这是非常了不起的（图4c和9，补充图S8和S9）。

在nifH数据库中，大多数（84%）检索到的读长对应于从 <0.22 μm大小分级的宏基因组组装的两个序列：OM-RGC.v2.008173703和OM-RGC.v2.008955342。前者与来自ε变形菌门（epsilon-proteobacterium）硝化菌DSM7299（以后称为Arcobacter），与nifH具有 99% 的同源性，后者在序列同源性上与γ变形菌门（gamma-proteobacteria）更接近。类似Acrobacter序列仅从表面和叶绿素浓度最大值（DCM）检索到读长，而类似γ变形菌门（gamma-proteobacteria）仅从表面、叶绿素浓度最大值（DCM）和海洋中层检索到读长（图10c）。这两个序列还从其他大小的片段中检索到读长（图7和补充图S12）。Arcobacter属的成员要么是共生体，要么是病原体，这与 TARA_158 站点叶绿素浓度最大值（DCM）水域中与 <0.22 μm尺寸片段相关的 >9% 的超小型浮游细菌不一致（补充图S12）。其他的变形菌序列（OM-RGC.v2.008817394）几乎完全从 <0.22 μm大小分级样品中检索读长（补充图S12）。总的来说，这些结果促使在未来的实地调查中纳入超小型固氮菌，以量化其潜在的生态和生物地球化学重要性。

总之，据我们所知，目前的研究首次尝试了使用配对图像和无 PCR 分子分析来评估全球海洋尺度上固氮菌的多样性、丰度、分布和生物量。与早期的研究不同，本研究包括固氮菌的完整生物学和生态复杂性：即单细胞、群落、颗粒相关、共生、蓝藻和无藻固氮菌（NCDs）。本研究发现固氮菌在全球尺度内分布并存在于所有大小的片段中，即使是在大西洋（AO）中特别丰富的超小型浮游细菌（<0.22 μm）中也是如此。出乎意料的是，我们在多个世界海洋和不同地理区域中几乎只检测到较大尺寸的淡水硅藻的专性共生体相似的序列。我们研究的一个主要结论是在以前采样不足的地区确定了固氮菌的新热点。该领域在过去试图进行范例转变，以支持一个占主导地位的群体（大直径与小直径蓝藻固氮菌）。相反，此处提供的数据支持具有多种生活方式的蓝藻固氮菌共存组合的区域（殖民的、自养的、共生的、粒子相关的），而无藻固氮菌（NCDs）似乎无处不在。总体而言，这项工作综合了全球海洋中固氮生物地理学的最新信息，在全球变化和海洋氮循环的大量人为扰动的背景下提供了有价值的信息。

图10.从不同水层的 <0.22 µm 尺寸分级样品获得的宏基因组中超小固氮菌的检测。通过标记基因nifH和recA之间的宏基因组读丰度的比值估计超小浮游细菌中固氮营养体的百分比。a 生物地理学，气泡的大小随固氮营养物的百分比而变化，而红色的叉表示没有（如未检测到nifH读长）；b 纬度的丰度梯度，圆圈表示固氮营养物样本，而交叉表示无重氮营养物。；c nifH序列的分类分布，OMRGCv2前缀表示从3 μm大小的宏基因组（包括0.22 μm）中组装得到的nifH序列。