科研 | 西北农大：不同时期覆盖作物下果园土壤中丰富和稀有微生物群落的组装过程（国人佳作）

编译：微科盟小木，编辑：微科盟茗溪、江舜尧。

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导读  

土壤微生物在农业生态系统中起着关键作用。然而，其动态多样性格局和群落组装过程却鲜为人知，特别是在农业系统中稀有微生物生物圈。本研究通过16S和ITS rRNA基因测序，研究了半干旱果园土壤中丰富和稀有细菌、真菌亚群落的多样性和组装过程对农业实践(即覆盖作物)的响应。结果表明，丰富类群和稀有类群的群落结构对覆盖作物和生长期的响应基本一致。生长期显著改变了细菌和真菌亚群落结构，覆盖作物只影响真菌亚群落结构。丰富真菌和稀有真菌的群落组装分别以随机过程和确定性过程为主，受覆盖作物和生长期的影响较小。对于丰富细菌，其组装过程主要以异质选择和非支配过程为主，而覆盖作物在坐果期和成熟期增加了异质选择过程的重要性。稀有细菌群落的组装过程以同质选择为主，成熟期扩散限制的相对重要性增加。丰富类群的组装过程与土壤DON、NH4+-N、NO3--N和pH显著相关，而稀有类群的组装过程与土壤DOC、AP和SOC显著相关。我们的研究结果为果园土壤微生物群落的形成提供了新的认识，特别是丰富和稀有细菌、真菌亚群落的季节演替。

论文ID

原名：Assembly processes of abundant and rare microbial communities in orchard soil under a cover crop at different periods

译名：不同时期覆盖作物下果园土壤中丰富和稀有微生物群落的组装过程

期刊：Geoderma

IF：6.114

发表时间：2021.10.19

通讯作者：翟丙年＆郑伟＆赵志远

通讯作者单位：西北农林科技大学资源与环境学院；农业部西北植物营养与农业环境重点实验室

DOI号：10.1016/j.geoderma.2021.115543

实验设计

2005年在陕西省白水县西北农林科技大学黄土高原苹果试验站(海拔838 m, 109°56′E, 35°21′N)建立了覆盖作物长期试验区，研究了覆盖作物对苹果产量和土壤肥力的影响。选用富士苹果(Malus pumila Mil.)树，自2008年以来，在一排排苹果树之间种植覆盖作物(油菜Brassica campestris)，在6月中旬播种，10月下旬修剪，然后将植物残茬犁入土壤。苹果的生长周期可分为四个主要阶段：萌芽期(4月中旬至5月中旬)、坐果期(5月下旬至6月中旬)、膨大期(6月下旬至9月下旬)和成熟期(10月上旬至10月下旬)。2019年，在4月中旬、5月下旬、8月中旬和10月上旬四个关键苹果生长期采集季节性土壤样品进行分析。

结果

1 处理土壤中丰富和稀有类群的分布和多样性

经过质量控制，在所有样品中鉴定出细菌和真菌的优质序列分别为1,415,080和1,559,116条，按照97%的序列相似性阈值分别划分为12,364个和4558个OTUs。在细菌中，OTUs被鉴定为稀有类群的比例很高(均值为19.7%)，但仅占每个样品平均相对丰度的8.8%。相比之下，低比例(均值为2.1%)的OTUs被鉴定为丰富类群，占每个样品平均相对丰度的53.5%(图S1a)。同样，在真菌中，15.8%的OTUs被鉴定为稀有类群，仅占每个样品平均相对丰度的1.9%。OTUs中被鉴定为丰富类群的比例相对较低(均值为2.4%)，但每个样本的平均相对丰度为91.9%(图S1b)。细菌和真菌的丰度占比相关性均显著，其中与稀有类群的相关性高于丰富类群。此外，所有样本均被丰富类群所占据，这一比例高于稀有类群(＜90%)(图S1c和S1d)。在细菌群落中，8808个OTUs和583个OTUs分别被划分为稀有类群和丰富类群。在真菌群落中，2809个OTUs被划分为稀有类群，仅有335个OTUs被划分为丰富类群(图S1e和S1f)。

在萌芽期，覆盖作物丰富和稀有细菌类群的丰富度和Shannon指数均高于对照，成熟期覆盖作物丰富和稀有细菌类群的丰富度和Shannon指数均显著低于对照(p＜0.05）(图1a和1c，表S1)。对于丰富真菌类群，覆盖作物下的丰富度和Shannon指数均显著低于对照(p＜0.05)，且不受生长期的影响。而稀有真菌的丰富度和Shannon指数随时间增加，且不受覆盖作物的影响(图1b和1d，表S1)。与α-多样性相同，各亚群落的NTI值在各处理中随时间的变化相似(图1e和1f)。丰富和稀有细菌群落的平均NTI值均小于零，覆盖作物下的NTI值波动频繁。而丰富和稀有真菌群落的NTI值在覆盖作物下的所有时期都保持相对稳定(图1，表S1)。丰富和稀有真菌类群的NTI值均小于零，且覆盖作物下的NTI值低于对照。

基于Bray-Curtis距离的CAP分析表明，影响细菌和真菌亚群落中稀有和丰富类群的土壤性质基本一致。例如，丰富和稀有细菌群落主要由SWC、DOC、DON、MBN、AK、AP和pH驱动，NO3--N也与稀有细菌结构的变化有关。对于真菌群落而言，SWC、DON、MBN、TN、AP、AK、pH和NO3--N与丰富类群和稀有类群的变化均显著相关(图2，表S2)。置换多元方差分析(PERMANOVA)表明，生长期对丰富和稀有细菌和真菌亚群落有显著影响。覆盖作物处理仅显著影响丰富和稀有真菌的群落组成(表S3)。在门水平上，在所有样品的细菌和真菌中，变形菌门(Proteobacteria)和子囊菌门(Ascomycota)分别是优势菌门(图S2a和S2d)；疣微菌门(Verrucomicrobia)、浮霉菌门(Planctomycetes)和迷踪菌门(Elusimicrobia)是细菌群落所特有的稀有类群，而球囊菌门(Glomeromycota)是真菌群落所特有的稀有类群。随着时间和处理的变化，稀有类群的菌门相对丰度的变化趋势比丰富类群更稳定(图S2)。在丰度方面，覆盖作物下厚壁菌门(Firmicutes)相对丰度为22%，CK下为1%。覆盖作物处理成熟期厚壁菌门相对丰度为22%，高于其他生长期(图S2b)。在丰富真菌类群中，覆盖作物下担子菌门(Basidiomycota)的比例为3%-7%，CK下担子菌门的比例为6%-41%(图S2e)。CK的担子菌在萌芽期占主导地位(41%)，在成熟期减少到21%，而在坐果期和膨大期则大幅降低。

图1 不同生长期土壤样品中丰富和稀有微生物的α-多样性。(a, c, e)不同生长期土壤样品中丰富和稀有细菌的Shannon、Richness和NTI。(b, d, f)不同生长期土壤样品中丰富和稀有真菌的Shannon、Richness和NTI。覆盖作物与生长期的双向方差分析（two-way ANOVA）结果如表S1所示。

图2 基于OTU水平Bray-Curtis距离的CAP分析确定了土壤微生物群落β多样性的驱动因素。(a-b) CAP显示了影响土壤中丰富和稀有细菌群落组成的生长期和环境变量。(c-d) CAP显示了影响土壤中丰富和稀有真菌群落组成的生长期和环境变量。SWC，土壤含水量；DOC，溶解有机碳；DON，溶解有机氮；EC，土壤电导率；MBC、微生物生物量碳；MBN、微生物生物量氮；TN，全氮；AK，速效钾；AP，有效磷；pH，土壤酸碱度；NO3--N，硝态氮；NH4+-N，铵态氮；SOC，土壤有机碳。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

图3概述了稀有和丰富亚群落的系统发育模式及其环境关联(如正相关或负相关)。丰富细菌亚群落的物种多属于变形菌门(Proteobacteria)和酸杆菌门(Acidobacteria)，而稀有细菌亚群落的物种多属于变形菌门。丰富和稀有真菌亚群落主要由子囊菌门(Ascomycota)和未分类的物种（unclassified）组成。厚壁菌门和担子菌门(Basidiomycota)中丰富类群与土壤养分含量显著相关，而这两个菌门中稀有类群与土壤养分含量无显著相关性。丰富细菌和真菌类群比稀有细菌和真菌类群具有更多的环境关联。

图3 稀有亚群落和丰富亚群落中最丰富的25种类群的系统发育模式及其环境关联(Spearman相关系数：正或负)。采用邻接法(NJ)建立系统发育树。可划分为属水平的分类单元用属名表示，否则用OTU ID表示。(a)丰富细菌，(b)稀有细菌，(c)丰富真菌，(d)稀有真菌。SWC，土壤含水量；DOC，溶解有机碳；DON，溶解有机氮；EC，土壤电导率；MBC、微生物生物量碳；MBN、微生物生物量氮；TN，全氮；AK，速效钾；AP，有效磷；pH，土壤酸碱度；NO3--N，硝态氮；NH4+-N，铵态氮；SOC，土壤有机碳。

  2 覆盖作物下丰富和稀有类群的组装过程

在丰富和稀有细菌、真菌群落中发现了显著的系统发育信号(图S3)，并使用RC-Bray和βNTI来量化微生物群落组装的确定性和随机性。丰富细菌的群落组成由确定性(59.78%)和随机过程(40.22%)共同决定，而丰富真菌亚群落的更替主要由随机过程形成(93.12%)。稀有细菌和真菌的组装大多是由确定性过程驱动的(图4e)。在不同处理下，与CK相比，覆盖作物处理在坐果期和成熟期的异质选择对丰富细菌群落组装的影响更大(图4a)。丰富真菌群落的群落组装受非支配过程主导(图4b)，而稀有细菌和真菌主要受处理间的同质选择过程的影响(图4c和4d)。在不同生长期，随着时间的推移，丰富细菌的群落组装主要受异质选择控制，而丰富真菌群落组装主要受不同生长期的非支配过程驱动(图S4)。在成熟期，异质选择和扩散限制过程对稀有细菌的贡献高于萌芽期、坐果期和膨大期(图S4)，而不同生长期的稀有真菌群落组装主要是由同质选择驱动的(图S4)。

图4 群落组装的确定性与随机过程。β-最近邻分类指数(βNTI)和Raup-Crick指数(RCI)均检测到这两个过程。(a-d)确定性和随机组装过程在形成每个生长期不同处理的丰富和稀有细菌、真菌亚群落中的相对影响。(e)确定性和随机组装过程对形成丰富和稀有细菌和真菌亚群落的相对影响。CK，无覆盖作物。

  3 丰富和稀有类群组装过程的驱动因素

为了探索决定丰富和稀有类群组装过程的主要土壤因素，我们通过比较βNTI值和每个环境变量(基于Euclidean距离矩阵)进行了Mantel检验。结果表明，影响群落系统发育变化的因素很多(表S4)。选择主要解释变量，以确定不同亚群落的组装过程与环境变量的相关性，即DON对丰富细菌，AP和DOC对稀有细菌，NO3--N、NH4+-N和pH对丰富真菌，SOC对稀有真菌(表S4)。DON和βNTI之间存在显著的正相关关系，表明DON的增加作为一个决定性的过程影响了丰富细菌亚群落的组装(图5a)。对于丰富真菌，NO3--N、NH4+-N和pH均与βNTI呈高度正相关关系(图5b-d)，βNTI分别随着NO3--N、NH4+-N和pH的增加而增加。此外，随着DON和AP的增加，稀有细菌群落的βNTI增加(图5e-f)；稀有真菌群落的βNTI与SOC的结果相似(图5g)。

图5 亚群落β-最近邻分类指数(βNTI)与土壤环境变量变化的Spearman相关性。(a)丰富细菌βNTI与土壤溶解有机氮(DON)差异的关系。(b-d) 丰富真菌βNTI与土壤硝态氮(NO3--N)、铵态氮(NH4+-N)和pH的关系。(e-f) 稀有细菌βNTI与土壤速效磷(AP)和溶解有机碳(DOC)差异的关系。(g) 稀有真菌βNTI与土壤有机碳(SOC)差异的关系。水平虚线表示+2和-2的βNTI显著性阈值。△:样品间土壤条件的变化。

  4 覆盖作物下丰富与稀有亚群落间的相互作用网络

基于Spearman相关系数构建了丰富和稀有细菌(真菌)的群落共现关系网络，评估了不同处理的共现模式(图6)。对于细菌和真菌，这些实验网络的平均聚类系数、平均路径长度、网络直径和模块性均高于同规模的Erdos-Reyni随机网络，表明网络具有“small world”性质和模块化结构(表S5)。进一步比较了两种处理下丰富细菌(真菌)和稀有细菌(真菌)的共现模式。结果显示，覆盖作物处理中细菌的连接数高于CK，而真菌的连接数低于CK(表S5)。值得注意的是，与CK相比，覆盖作物处理中细菌的正连接(丰富-丰富、稀有-稀有和丰富-稀有)多于负连接。与此相反，覆盖作物处理中真菌的正相关(丰富-丰富、稀有-稀有和丰富-稀有)比CK低(图6)。

图6 基于相关分析的土壤丰富和稀有类群共现网络。下表总结了不同处理下每个亚群落之间的联系。网络的拓扑特性及其同规模的Erdos-Reyni随机网络如表S5所示。

讨论

1 覆盖作物和生长期对丰富和稀有类群群落结构的影响

丰富和稀有类群的群落结构对覆盖作物或生长期的响应总是相似的(表S3)，这种相似的响应可能是因为影响丰富和稀有群落结构的土壤性质大致相同(图2，表S2)。但在门水平上，稀有细菌和真菌门的相对丰度随时间和处理的变化往往比丰富类群的丰度变化更稳定，如厚壁菌门和担子菌门(图S2)。其中，疣微菌门(Verrucomicrobia)、浮霉菌门(Planctomycetes)和迷踪菌门(Elusimicrobia)为细菌稀有类群所特有，而球囊菌门(Glomeromycota)为真菌稀有类群所特有，但这些门的相对丰度随时间和处理均无明显变化。以往的研究表明，与稀有类群相比，丰富类群可以有效地利用更广泛的资源，具有更强的环境关联性。在本研究中，厚壁菌门和担子菌门中丰富类群与土壤养分含量显著相关，而这两个菌门中稀有类群与土壤养分含量没有任何关联(图3)。此外，稀有类群仅存在于80%-90%的土壤样品中(图S1)，这可能是由于稀有类群的竞争能力和生长率较低，对覆盖作物或生长期引起的环境变化的响应有限。研究结果表明，在OTU水平上，丰富类群和稀有类群对覆盖作物和生长期的响应相似。在门水平上，丰富类群的相对丰度可能比稀有类群对覆盖作物或生长期引起的环境变化更为敏感。

一些报道表明，覆盖作物可以影响细菌和真菌的群落结构。然而，在我们的研究中，只有丰富和稀有真菌群落结构被覆盖作物显著改变(表S3)。对这些结果的一个可能的解释是，由于CK采用了常规的全地表杂草控制，而覆盖作物的植物多样性水平较高。造成这一现象的另一个原因可能是细菌和真菌亚群落结构受到不同土壤因子的驱动。CAP分析表明，真菌亚群落结构受TN和NO3--N的影响(图2，表S2)，覆盖作物对真菌亚群落结构影响显著(图S5)。在共现网络中，积极的相互作用主要被视为合作。覆盖作物增加了细菌群落中的丰富-丰富和稀有-稀有类群正连接，但减少了真菌群落中的丰富-丰富和稀有-稀有类群正连接(图6)。丰富或稀有细菌内部频繁的合作可能有助于其群落在环境变化下的恢复能力，因为微生物的相互作用网络可以为环境干扰提供缓冲。因此，这一结果也可能是对丰富和稀有细菌群落结构受覆盖作物的影响小于丰富和稀有真菌群落的探索。

2 覆盖作物和生长期对丰富和稀有亚群落组装的影响

阐明群落组装机制是微生物生态学领域的一个重要研究领域。在本研究中，我们发现了丰富和稀有细菌、真菌群落的显著系统发育信号(图S3)，表明量化最近亲缘间的系统发育变化是正确的。我们用NTI和βNTI确定了丰富和稀有细菌和真菌的组装过程。结果表明，丰富细菌群落组装主要由异质性选择和非支配过程驱动，而非支配过程主要控制丰富真菌群落组装。稀有细菌和真菌群落组装主要是由同质选择驱动的(图4)。这一结果可能是由于强烈的同质选择导致类群稀少，因为稀有类群占据非常狭窄的环境生态位，并经常与其他物种相互作用。此外，丰富和稀有细菌、真菌的NTI平均值均小于零，稀有真菌的NTI值低于丰富真菌，说明丰富真菌比稀有真菌在系统发育上更分散(生态上与自身的差异更大，图1e和1f)。这些结果与以往的研究结果一致，即稀有类群受确定性过程的影响较大，比丰富类群具有更强的系统聚类性。然而，以往的研究表明，稀有类群受到土壤随机过程的限制。这些不一致的结果可能是由于调查的不同土壤环境和生物地理学被认为是群落组装的主要驱动因素。

正如我们所预料的，在坐果期和成熟期，覆盖作物丰富细菌异质选择的相对重要性高于CK(图4a)，这与我们的第二个假设是一致的。丰富细菌的βNTI与DON显著相关，这两个阶段覆盖作物DON显著高于CK(图S5)。覆盖作物增加的资源含量可能对这一异质过程产生影响。相反，在覆盖作物和CK的每个生长阶段，丰富真菌的群落组装主要受随机过程控制(图4b)。结果表明，覆盖作物对土壤NH4+-N和pH没有显著影响(图S5)，覆盖作物显著提高了NO3--N含量。覆被作物引起的NO3--N变化可能不会使βNTI超过阈值(-2或+2)，说明丰富真菌的组装主要是由随机过程驱动的，受覆盖作物影响较小。这些结果与Jiao的研究结果一致，即在丰富真菌亚群落中，随机过程占优势。与丰富细菌和真菌相比，在这两个处理中，稀有细菌和真菌群落的组装被同质选择过程所主导(图4c和4d)。这些结果可能是由于土壤养分、DOC、AP和SOC与确定性过程显著相关，而不受覆盖作物的影响(图S5)。我们的结果支持了之前的研究报告，即稀有细菌和真菌的组装主要由确定性过程控制。

丰富细菌、丰富真菌和稀有真菌的群落组装受生长期的影响较小。但在成熟期，扩散限制对稀有细菌的贡献高于萌芽期、坐果期和膨大期。可能的解释是，成熟期的DOC和AP值较高(图S5)。土壤养分的大规模转移预计将促进土壤细菌群落的组成变化。与稀有细菌群落不同的是，稀有真菌群落在不同生长阶段均以同质选择过程为主。细菌和真菌在生长习性上有很大的不同，这可以部分解释这些差异。细菌和真菌分别以单细胞和丝状生长为特征，这可能影响它们的扩散能力。

3 多种因素介导丰富和稀有细菌、真菌的组装过程

在群落生态学中，揭示导致不同微生物群落组装过程的因素是十分必要的。以往对湿地和冰川土壤的研究表明，组装过程与土壤的pH、NH4+-N等性质有关。最近的一项覆盖作物研究表明，组装过程受到土壤SOC和TN含量的显著影响。我们发现丰富细菌的βNTI与土壤DON相关，丰富真菌的βNTI与土壤NH4+-N、NO3--N、pH相关。此外，稀有细菌的βNTI与土壤DOC和AP显著相关，而稀有真菌的βNTI与SOC显著相关(图5)。这些结果表明，丰富和稀有细菌、真菌群落的组装过程受到不同土壤性质指标的影响，这与我们的第三个假设一致。此外，丰富细菌和真菌亚群落的βNTI与氮营养物质(例如，DON对细菌，NH4+-N和NO3--N对真菌)的相关性最大，而稀有细菌和真菌亚群落的βNTI与碳营养物质(例如，DOC对细菌和SOC对真菌)的相关性最大。这可能表明丰富类群和稀有类群的生态位并不完全相同。前期研究发现疣微菌门、浮霉菌门和球囊菌门与SOC含量均有较强的相关性，这可能支持了上述观点。结果还表明，土壤pH对丰富真菌组装的影响显著，而对稀有真菌组装的影响不显著；AP对稀有细菌组装的影响显著，而对丰富细菌组装的影响不显著。可能的解释是：本研究中大多数丰富细菌没有磷转化功能或有足够的细胞磷储存；稀有真菌可能对环境pH不敏感，并能耐受其显著偏差。

结论

本文研究了果园土壤中丰富和稀有细菌、真菌亚群落的多样性和组装过程对不同生长期长期覆盖作物处理的响应，这为丰富和稀有真菌群落结构受生长期和覆盖作物的显著影响提供了证据。丰富和稀有细菌亚群落结构仅随生长期发生显著变化。在门水平上，细菌和真菌丰富类群的相对丰度随生长期和覆盖作物的变化而变化，而细菌和真菌稀有类群的相对丰度随时间和处理的变化不明显。不同处理对丰富和稀有细菌和真菌在不同生长期的响应和组装过程存在差异。丰富真菌亚群落以随机过程为主，而稀有真菌亚群落以确定性过程为主。覆盖作物在坐果期和成熟期增加了丰富细菌的异质选择过程的重要性，而稀有细菌的组装过程受生长期的影响而非覆盖作物的影响。结果表明，土壤中丰富和稀有细菌、真菌组装对覆盖作物和生长期的响应不同，这是因为驱动丰富和稀有细菌、真菌群落组装的土壤因子不同。