向死而生：肿瘤细胞对CAR-T治疗的耐药机制，以及如何规避？

  CAR-T细胞疗法  

近几年已有多个CAR-T细胞产品问世，这一疗法给了既往多线治疗失败的患者以希望，包括弥漫大B细胞淋巴瘤、B细胞急性淋巴细胞白血病、多发性骨髓瘤、套细胞淋巴瘤和滤泡淋巴瘤等。

然而，即使CAR-T疗法的疗效显著，仍有相当一部分患者对其原发或继发耐药，CAR-T细胞治疗耐药的机制可涉及CAR-T细胞（增殖不足、持久性不足、效应子功能缺陷/衰竭）、肿瘤微环境[运输受损、代谢/缺氧，免疫抑制：包括免疫抑制细胞（基质、骨髓细胞、调节性T细胞）和免疫抑制性细胞因子(TGF-b、IL-10、IL-35) ]以及肿瘤细胞自身[靶抗原丢失、抑制性配体（PD-L1）表达、缺乏共刺激配体（CD58丢失）、免疫杀伤抵抗]等因素。

来自法国的Roch Houot教授等近期发文于《CLINICAL CANCER RESEARCH》杂志（IF= 12.531），详细描述了肿瘤细胞自身对CAR-T治疗耐药的内在机制，包括靶抗原丢失、抑制性受体表达、共刺激配体缺乏和免疫杀伤抵抗等；同时，作者还讨论了可以基于肿瘤细胞因素规避CAR-T耐药的潜在策略。

  靶抗原丢失

到目前为止，靶抗原丢失一直是研究最广泛的机制，它可以导致癌细胞耐药或逃避CAR -T细胞治疗（图1）。靶抗原阴性克隆的复发，可能是由于免疫编辑（immune-editing）导致预先存在的抗原阴性亚克隆选择性生长，也可能是由于肿瘤细胞初始表达的靶抗原获得性丢失。

发生率

不同组织学患者的抗原丢失发生率也不同，B细胞急性淋巴细胞白血病（B-ALL）中，CD19丢失约占CAR-T治疗复发患者的7-25%，CD19阴性复发可能与淋巴细胞清除时的高肿瘤负荷有关；弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）中约有1/3的复发患者存在CD19丢失或下调；在套细胞淋巴瘤中，有一项研究纳入60例患者，其中14例复发，复发患者中有1例（7%）为CD19无法检测；滤泡淋巴瘤ZUMA-5研究中，所有13例进展患者均可检测CD19；一项BCMA CAR-T治疗的多发性骨髓瘤（MM）研究中，12例中有1例（8%）复发时存在BCMA丢失；另一个BCMA CAR-T研究中，18例患者输注后持续表达，但有12例（67%）出现了BCMA强度或骨髓瘤细胞下降，包括未缓解9例患者中的4例。

此外有个问题也极为重要，那就是CD19 CAR-T治疗后CD19阴性或低表达的白血病或淋巴瘤细胞仍可表达其他B细胞标志物，如B-ALL的CD22，淋巴瘤的CD20和CD79a。

机制

抗原阴性复发的机制包括：预先存在的抗原阴性肿瘤细胞的选择性、突变或剪接变异、影响靶抗原成熟/转运的改变、表位遮蔽和谱系转换/转分化等，见图1。

大多数关于抗原丢失机制的数据来自CD19 CAR-T细胞在儿科B-ALL中的临床经验，对来自费城儿童医院的628例复发或难治性(R/R)B-ALL进行流式细胞仪分析后发现，在启动任何治疗之前，约17%的病例有阴性肿瘤细胞CD19表达>1%，此外有7%的患者CD19表达降低，其中1/4的患者CD19表达低于正常。

因此，相当数量的患者肿瘤细胞在治疗前便预先存在靶抗原膜表达缺失或较低，并可由CAR-T细胞的免疫压力进一步选择。这种CAR-T细胞介导的免疫编辑形成了初始的肿瘤异质性，有利于行成靶抗原阴性复发。此外，如果既往暴露于CD19双特异性T细胞衔接器(BiTE)blinatumomab，也与CAR-T细胞治疗后CD19阴性复发率显著升高相关。

突变

对17份儿童和年轻成人R/R B-ALL患者样本的流式细胞仪分析显示，其中12例患者为CD19阴性，且在所有12例患者中均发现了CD19结构域突变，这些突变可导致跨膜结构域无功能或截短蛋白缺失。

此外，在接受CD19 CAR-T细胞治疗的难治性DLBCL患者中也报告了影响CD19表达的此类突变（图1B）。

可变剪接

Sotillo等通过比较相同患者复发时的CD19阴性样本与CAR-T治疗前的CD19阳性样本，发现了可变剪接（Alternative splicing）是CD19丢失机制之一。他们发现，B-ALL表达的几种CD19剪接变异体，尤其是影响外显子-2（exon-2），可导致用于CAR-T细胞识别的CD19胞外表位丢失。

此外，可变剪接还可导致跨膜结构域缺乏，从而阻止CD19在细胞表面表达。最近有报道认为，诊断时可存在“缺乏CAR-T细胞识别的CD19表位”的CD19亚型，而该亚克隆可能在CAR-T治疗过程中演化为优势克隆，从而促进抗原阴性复发，见图1B。

抗原加工缺陷

CD19成熟/转运缺陷是CD19/CD3 BiTE blinatumomab耐药的原因之一。CD81是一种伴侣蛋白，它可以调节CD19蛋白成熟和从高尔基体运输到细胞表面，在患者中，转录后调节可导致CD81缺失，从而阻断了高尔基体中CD19的加工和成熟，并且这一改变可导致B-ALL患者在blinatumomab治疗完成后19个月抗原阴性复发。

BiTE的这一耐药机制也可能与CAR-T细胞共享，但尚无报道（见图1C)。

表位遮蔽

Ruella等曾报道，在CAR-T细胞制造过程中，CAR基因可插入到单个白血病B细胞中，CAR在原始细胞表面的表达可遮蔽CD19表位，从而阻止CAR-T细胞对肿瘤细胞的识别。在1例B-ALL患者中观察到了该罕见事件，该患者在接受CD19 CAR-T细胞治疗后9个月复发。现在大多数CAR-T制造方案都包括了T细胞选择过程，以避免这种潜在的并发症（图1D)

谱系转换/转分化

谱系转换也可导致抗原丢失，但与上述机制不同，谱系转换不仅可导致CD19丢失，还可导致更广泛的表型转换，从而获得急性髓系白血病(AML)标志物。据报告，在SCRI研究的2例CD19 CAR-T细胞治疗的MLL重排B-ALL患者和另1例患者在CD19 CAR-T细胞治疗后发生CD19阴性逃逸的谱系转换。另较为罕见的是，有报道显示1例患者在CD19 CAR-T细胞后出现了套细胞淋巴瘤转分化为低分化肉瘤，这种转分化过程与CAR-T细胞输注两个月后负责肿瘤发展的表观基因组的重大改变有关（图1E)。

克服抗原低表达/阴性复发的策略  

抗原低表达复发可通过增加CAR-T细胞对其靶点的敏感性来预防，而抗原阴性复发可以通过靶向多个抗原，或以非抗原依赖性方式杀死肿瘤细胞来克服。并且不管上述哪种情况，通过再诱导（re-induce）或增加抗原表达的策略都可能有获益（见表2）。

增强CAR-T结构敏感型，预防低抗原复发

为识别低表达的抗原，目前已开发了具有高亲和力单链可变片段(scFvs)的CAR-T细胞。在体外，携带高亲和力scFv的CAR-T细胞在极低水平表达时也可识别其靶抗原，包括通过流式细胞术检测不到靶抗原。此外，在CD28和4-1BB CAR-T细胞中，加入免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)可增强细胞内信号转导的强度，从而能够识别抗原密度较低的肿瘤细胞。最后，铰链区也可影响CAR-T细胞结合其表位的能力，例如，用CD28-铰链-跨膜区替代4-1BBζCAR的CD8铰链-跨膜区，即可降低CAR反应性阈值并增强对CD19-低表达白血病细胞的杀伤。

上述方法在CD22和BCMA CAR-T细胞治疗复发的情况下可能尤其有益，因为患者在免疫治疗后常为伴CD22dim或BCMAdim复发（BCMA表达分为dim、moderate和bright expression，分别为ABC < 500、501–1100和 >1101），而CD19 CAR-T细胞后复发大多表现为CD19完全丢失。

靶向多个抗原的CAR-T细胞，预防抗原阴性复发

在启动任何治疗之前，由相当一部分患者携带既存的抗原阴性肿瘤细胞，这种初始肿瘤异质性可能导致CAR-T细胞治疗后复发。

为了克服抗原阴性复发，可以通过输注具有独特但不同特异性的CAR-T细胞混合物或输注具有多种特异性的CAR-T细胞来实现，不同特异性的CAR-T细胞可同时或序贯给药。在一项I期试验中，21例B-ALL患者接受了CD22 CAR-T细胞治疗，其中17例既往接受过CD19靶向免疫治疗（CD22在大多数B-ALL病例中表达，通常在CD19缺失后保持）。在本研究中，所有5例CD19dim或CD19阴性B-ALL患者在接受 > 1 × 106个CD22 CAR-T细胞治疗后均达到完全缓解，中位缓解持续时间为6个月。并且有趣的是，复发与肿瘤细胞CD22表达下降有关。同样，Baird等人也报告了3例接受CD22 CAR-T细胞治疗并达到完全缓解的CD19 CAR耐药DLBCL患者。

Pan等假设，一线连续给予靶向不同抗原的2种CAR-T细胞产品可能改善长期结局，他们进行了一项I期试验，在R/R B-ALL儿童患者中评价CD19和CD22 CAR-T细胞序贯给药。接受序贯CAR-T细胞治疗的20例患者中有17例(85%)在研究结束时保持CR，3例在6.6、6.9和11.4个月时复发，1年PFS和OS分别为79.5%和92.3%。在复发患者中，1例的白血病细胞CD22下调，2例患者CD19抗原丢失。

学者还开发了具有多个特异性的CAR-T细胞产品：tandem (或bivalent) CARs，单个胞外域上含有两个独特的抗原结合位点；bicistronic CARs，使用单载体编码两个独特的CARs，可以通过各自的胞外基序同时靶向于两个不同的位点。对12例R/R B-ALL患者给予CD19/CD22 tandem CAR结构：11例达到CR，1例原发性疾病进展伴CD19保留。在最近一项成人R/R B-ALL的研究中，6/6例输注患者在输注tandem CD19/CD22 CAR-T细胞后达到MRD阴性CR。值得注意的是，1例患者在输注后5个月复发，原始细胞为CD19阴性和CD22低表达。

上述策略也被应用于R/R侵袭性B淋巴瘤。在一项I期剂量递增研究中，11例患者（5例DLBCL、4例MCL、2例CLL）接受CD19/CD20 tandem CAR-T细胞治疗。第28天的ORR为82%（6/11例CR和3/11例PR）。所有进展患者均保持CD19或CD20阳性，表明存在抗原丢失之外的其他耐药机制。

AUTO3研究在儿童R/R B-ALL中评价了靶向CD19和CD22的bicistronic CAR-T细胞，CAR-T细胞输注后，所有7例可评价患者均达到CR/CRi，微小残留病(MRD)为阴性。共有3例复发，包括1例CD19阴性/CD22低表达。可见即使在多靶点策略下，仍可观察到抗原逃逸这一耐药机制。在I期Alexander研究中也对该bicistronic结构联合PD1抗体派姆单抗治疗R/R DLBCL进行了评价。在本研究中，接受剂量> 50 × 106治疗的11例患者中，ORR和CRR分别为64%和55%，毒性可接受且与靶向单一抗原的CAR-T细胞一致。

CAR-T细胞以非抗原依赖性方式杀死肿瘤细胞

装甲CAR-T细胞可以分泌免疫刺激细胞因子（IL12 或IL18)或表达共刺激配体（CD40L、Flt3L、或4-1BBL)，从而可以增强CAR-T细胞疗效和/或生成/招募自然抗肿瘤T细胞的能力。

分泌IL12和IL18的装甲CAR-T细胞在临床前模型中已表现出活性增强。CAR-T细胞分泌IL12可导致抗肿瘤疗效增加，IL12以自分泌的方式增加CAR-T细胞的抗肿瘤功能，还可以重塑肿瘤微环境，使CAR-T细胞可以抵抗调节T细胞和髓源性抑制细胞的免疫抑制。Avanzi等设计的装甲分泌IL18的CAR-T细胞，可增加IFN-γ分泌并调节肿瘤微环境，使之趋向于IFN-γ签名，从而使这些分泌IL18的CAR-T细胞能够调节肿瘤微环境，增强内源性抗肿瘤免疫反应。

除了上述IL12和IL18，Kuhn等开发了可以结构性表达CD40L的CAR-T细胞，该结构能够使CAR-T细胞上表达的CD40L与CD40阳性肿瘤细胞（导致直接细胞毒作用）和抗原呈递细胞(APC)结合。CD40L-CD40相互作用可触发肿瘤旁APC的活化，以及CD40、CD86和主要组织相容性复合体(MHC)Ⅱ等共刺激分子的表达增加。因此，CAR-T细胞结构性表达CD40L可生成内源性抗肿瘤T细胞，它可识别肿瘤细胞并通过其TCR作用杀伤肿瘤细胞，从而预防单个抗原丢失造成的免疫逃逸风险。同样，Lai等改造的T细胞可以分泌树突状细胞(DC)生长因子Fms样酪氨酸激酶3配体(Flt3L)，该结构可诱导内源性T细胞活化，通过扩增肿瘤内APCs使其可以靶向于更广泛的肿瘤抗原，从而显著改善肿瘤反应。

CD80和4-1BBL等共刺激配体也可在CAR-T细胞上表达，以刺激旁观者内源性（bystander

endogenous）和CAR-T细胞（反式激活）。CD80和4-1BBL可分别与T细胞上表达的CD28和4-1BB两种共刺激受体结合，而过表达CD80和4-1BBL的人初始T细胞已证明可以非常有效地根除肿瘤细胞，即使无共刺激配体。此外，表达CTL的CD80/4-1BBL还能够诱导旁观者T细胞反式共刺激（旁观者的意思，个人理解为未结合抗原的T细胞）。上述策略可应用于CAR-T细胞，通过局部刺激内源性T细胞，它们可以非靶向抗原的形式促进/增强肿瘤细胞杀伤。

其他死亡信号通路也可能用于CAR-T细胞杀伤癌细胞，且是靶向抗原之外的形式。例如，低剂量辐射可诱导肿瘤细胞表面的死亡受体（如trail受体）表达，从而使肿瘤细胞对CAR-T细胞TRAIL介导的细胞凋亡敏化。抗原阳性肿瘤细胞激活的CAR-T细胞则可通过死亡受体途径诱导旁观者杀伤抗原阴性肿瘤细胞。该策略可同时增加中靶和旁观者CAR-T细胞的细胞毒作用，即使在抗原丢失变异的情况下也能够实现肿瘤控制。

减少靶细胞表面抗原丢失

尽管CAR-T细胞可以非靶抗原依赖的形式发挥作用，但其疗效仍与细胞膜上靶抗原的密度紧密相关，因此，CAR-T细胞结合可增加肿瘤细胞上靶抗原表达的治疗极为重要。BCMA CAR-T细胞治疗多发性骨髓瘤的疗效，会被肿瘤细胞表面γ-分泌酶的BCMA裂解所限制，从而降低了骨髓瘤细胞上的配体密度。而在小鼠模型中，抑制γ-分泌酶活性可减少靶细胞的抗原损失，并提高BCMA CAR-T细胞的抗肿瘤疗效。

在表位遮蔽的情况下消耗肿瘤细胞   

在CD19 CAR-T细胞生产过程中，B-ALL原始细胞的意外转导可通过表位掩蔽导致CD19 CAR-T细胞治疗耐药，当前抗CD19 CAR独特型CAR已被开发用于特异性识别和消耗转导的B-ALL原始细胞。

  抑制性配体(PD-L1)  表达

CAR-T和PD-L1轴是一种众所周知的免疫检查点抑制剂通路，而肿瘤细胞或其微环境可表达抑制性配体PD-L1和PD-L2，这些配体与其受体（即CAR-T）结合后可阻止T细胞活化，从而实现免疫逃逸（图2A）。

发生率

PD-L1/L2在B细胞恶性肿瘤中可表达。例如在R/R DLBCL中，16%的可评价样本存在低水平拷贝增加，其中3%为9p24.1扩增，而该位点编码PD-L1和PD-L2。通过免疫组学，46例中的4例(9%)在活检标本上显示PD-L1膜表达；原发性纵隔大B细胞淋巴瘤(PMBCL)经常与9p24基因畸变相关，导致肿瘤表达PD-L1和PD-L2；此外PD-L1在B-ALL亚组中也有表达。

机制

CAR-T可在活化的CAR-T细胞上表达，而肿瘤细胞或肿瘤微环境表达的PD-L1可能抑制CAR-T细胞的细胞毒性并诱导免疫耐药性。Neelapu等人表明在ZUMA-1试验中Axi-Cel治疗后进展的21例DLBCL患者中，13例(62%)表达PD-L1，因此，CAR-T抑制剂可能会增强CAR-T细胞治疗的疗效。

克服PD-L1介导耐药的策略

几种策略可以克服PD-L1介导的免疫抑制，包括CAR-T细胞联合抗PD1/PD-L1抗体、抗CAR-T分泌型CAR-T细胞或PD-L1耐药CAR等（见表2）。

CAR-T细胞联合抗CAR-T/PD-L1单抗

当前CAR-T细胞联合抗CAR-T/PD-L1抗体有两个策略：CAR-T细胞治疗后复发时；CAR-T细胞输注时（即前期）。

目前仅有少数研究探索这一组合策略，在一项单中心研究中，12例CD19 CAR-T细胞治疗后复发或进展的DLBCL患者接受了抗PD1单抗帕博利珠单抗治疗，11例可评价患者中，1例达到CR，2例PR，1例SD，7例PD。有趣的是，通过转基因拷贝数测量，12例患者中的9例显示CAR-T细胞再扩增。然而，在这个小队列中，CAR-T细胞的峰值与临床反应之间并无相关性。

在另一项小型研究中，6例DLBCL患者在CAR-T细胞输注后21-28天接受抗PD-L1单抗 durvalumab，9例患者在输注前一天接受durvalumab治疗结果总有效率为50%；中位随访10.6个月，5例达到CR的患者中仅1例复发。在本研究中，5/13例患者发生细胞因子释放综合征(CRS)，包括1例4级事件，1例患者发生神经毒性。

ZUMA-6研究中，R/R DLBCL患者给予CD19 CAR-T细胞联合抗PD-L1单抗 atezolizumab治疗，在CAR-T细胞输注后D21、D14或D1开始给予atezolizumab。最常见的3-4级不良事件为贫血(9/12)、脑病(5/12)和中性粒细胞减少(5/12)；分别有3/12和6/12例患者发生3-4级CRS和神经毒性；中位随访4.4个月，10例患者中9例达到ORR，包括6例CR和3例PR。

ALEXANDER研究为双特异性CD19/CD22 CAR-T细胞联合帕博利珠单抗，在>50 × 106剂量治疗的11例患者中，ORR和CRR分别为64%和55%；未发生任何级别的重度CRS或神经毒性。

上述研究结果表明，免疫检查点抑制剂与CAR-T细胞的联合策略可能部分患者亚组有益，也表明其他耐药途径可能发挥至关重要的作用。

抗CAR-T分泌型CAR-T细胞

Rafiq等开发了能够分泌CAR-T阻断性scFv的“装甲”CAR-T细胞，它以旁分泌和自分泌的方式发挥作用。在小鼠模型中，这些CAR-T细胞对表达PD-L1的肿瘤的疗效至少与CAR-T细胞与抗CAR-T单抗的组合一样优秀。此外这类CAR-T细胞还可局部递送抗PD1 scFv抗体，可能会限制检查点抑制剂全身暴露的毒性。

PD-L1耐药CAR

CAR-T细胞可被改造为对CAR-T信号传导抵抗，原理是通过CRISR-Cas9技术敲除PD1基因或通过转导CAR-T显性负性受体。CAR-T细胞也可以用PD1/CD28嵌合开关受体转导，该受体含有与共刺激分子CD28的跨膜和胞浆结构域融合的PD1胞外域，PD-L1与其受体(PD1)的连接可通过CD28胞质结构域传递激活信号，而非通过CAR-T胞质结构域转导的抑制性信号。临床前模型已证明这些CAR-T细胞可抵抗CAR-T介导的抑制。

  缺乏共刺激配体（CD58丢失）

CD58是人类T细胞上表达的CD2分子的配体，CD2通过TCR信号为T细胞增殖、细胞因子生成和活化提供共刺激信号。与自然细胞毒性T细胞相似，CD2连接对于肿瘤细胞杀伤所需的CAR激活和细胞骨架重排至关重要（见图2B）。

发生率

在大约1/4的DLBCL中可观察到CD58改变（突变或表达缺失）。此外，CD58改变与CD19 CAR-T细胞治疗后的较差预后相关。

机制

CD58改变可能是由于IHC测定的突变或表达缺乏所致。在临床前模型中，CD58改变可降低CAR-T细胞活化和细胞毒性。

克服共刺激配体缺乏的策略

通过添加第二个CAR结构（CAR胞质尾部结合有CD2信号结构域），可以克服CD58-CD2信号缺乏的情况（见表2），CAR与其靶抗原结合后可诱导CD2信号，这一信号是独立于肿瘤细胞表达CD58。这种结构在临床前模型中表现出活性增加，但尚未在患者中进行试验。

  免疫杀伤抵抗

肿瘤细胞可通过一种称为“固有耐药”的机制，抵抗CAR-T细胞带来的免疫杀伤作用（见图2C）

发生率

肿瘤细胞对CAR-T细胞杀伤存在固有抵抗，但在血液系统恶性肿瘤中的流行率仍不清楚。

机制

肿瘤细胞中受损的凋亡机制可以使肿瘤细胞抵抗CAR-T细胞的免疫杀伤。在B-ALL和B细胞淋巴瘤细胞系中的两项研究便揭示，细胞凋亡的死亡受体通路在介导CAR-T细胞毒性上有关键作用，破坏与促凋亡死亡受体信号通路相关的基因（如FADD、BID、CASP8和TNFRSF10B）可抵抗CAR-T细胞杀伤，相反，敲除抗凋亡基因(如CFLAR、TRAF2和BIRC2)可增加对CAR-T细胞杀伤的敏感型。

Singh等使用来自复发/难治性儿童和成人B-ALL的两项多中心试验的样本发现，与无应答患者（尽管保持CD19表达）相比，获得完全缓解的患者样本中死亡受体信号签名显著更高。

克服免疫杀伤抵抗的策略

可以通过提高肿瘤细胞对死亡受体介导凋亡的敏感型这一策略（见表2）。已发现几种癌症治疗药物可调节肿瘤细胞调节死亡受体的表达，包括DNA损伤剂、组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂、蛋白酶体抑制剂、环氧合酶-2(COX2)抑制剂、BCL-2抑制剂等，但均为临床前模型，未进入临床测试。

总结   

0  1 耐药机制  

在CAR-T细胞领域，靶抗原的缺失一直是最具特征性的耐药机制，克服的策略包括针对多种抗原的CAR-T细胞等。癌细胞逃避CAR-T-细胞治疗的其他耐药机制，包括抑制性配体表达、共刺激配体缺乏和对CAR-T杀伤的内在抵抗。

0  2 广泛理解  

从更广泛的角度来看，有三个因素可能导致CAR-T细胞耐药：肿瘤细胞、肿瘤微环境和CAR-T细胞自身。此外，肿瘤微环境在实体瘤中的作用可能尤为重要，因为非造血组织中存在细胞外基质和细胞因子环境复杂等因素。新型CAR-T细胞的设计应解决所有三个因素的耐药机制。

0  3 未来期望  

随着CAR-T领域的进展，如何确定每个肿瘤个体的耐药机制，以便用最佳产品或组合给予个性化的CAR-T细胞治疗将变得越来越重要。