Nature：张元豪团队揭示染色体外DNA中心促进癌症的分子机制

撰文 | xiaoxia 编辑 | 王多鱼 排版 | 水成文

染色体外DNA （ecDNA） 在人类癌细胞中普遍存在，通过基因扩增和改变基因调控来介导癌基因的高表达。基因诱导一般涉及顺式调控元件，它们接触并激活同一染色体上的基因。 编码癌基因的ecDNA是癌症基因组的普遍特征。ecDNA是共价闭合的双链，大小从100kb到几兆碱基不等。因为缺乏着丝粒，故ecDNA在细胞分裂过程中被随机分隔到子细胞，因此也可作为某些染色体扩增的前体。ecDNA在细胞分裂期间或DNA损伤后会相互聚集，目前对ecDNA聚集后产生的的生物学后果了解甚少。 2021年11月24日，斯坦福大学 张元豪 （Howard Chang） 教授团队在 Nature 发表了题为： ecDNA hubs drive cooperative intermolecular oncogene expression 的研究论文。 该研究发现， ecDNA的局部聚集促进了新的分子间增强子-基因相互作用和癌基因过表达 。并发现与蛋白质相连的 ecDNA中心 （ecDNA hubs） 能够实现分子间转录调控，并可以作为致癌基因功能和协同进化的单位，也可以作为癌症治疗的潜在靶点。未来的研究可能会发现在各种癌症类型中介导ecDNA转录活性的蛋白质，并可将其作为潜在的治疗靶点。 为了了解间期细胞核中的ecDNA的聚集点，该研究团队通过DNA荧光原位杂交 （FISH） 去观察。在该研究团队评估的所有ecDNA阳性癌细胞中，ecDNA荧光原位杂交局部集中在间期细胞核中，这表明ecDNA彼此强烈聚集，研究团队称之为ecDNA中心。结果表明，在具有不同癌基因扩增的各种癌症类型和原发性肿瘤中均存在ecDNA聚集。  

癌基因MYC的两侧是由组蛋白H3乙酰化赖氨酸27 （H3K27ac） 和末端外结构域蛋白如BRD4为标记的超级增强因子。为了检查活细胞中的MYC ecDNA，研究团队在结直肠癌细胞系 （COLO320-DM） 细胞中MYC ecDNA中插入了Tet-operator （TetO） 阵列，并用Tet-eGFP标记了ecDNA，来尽量减少GFP二聚化。活细胞成像显示有多个动态核病灶，对应于聚集的ecDNA。内源性BRD4的表位标记显示，BRD4在TetO标记的ecDNA中心高度富集。通过对H3K27ac和BRD4进行测序和染色质免疫沉淀来分析染色质，结果表明标记活性H3K27ac的ecDNA实际上也被BRD4占据。  

为了将ecDNA结构与MYC转录调控联系起来，研究团队使用五种正交方法重建了等基因结直肠癌细胞系 （COLO320-DM） 的ecDNA，并研究了目前已知的组装的最大的ecDNA结构。研究团队在COLO320-DM细胞中观察到了浆细胞瘤转化迁移基因1 （PVT1） 启动子处的强BRD4结合，但在COLO320-DM ecDNA细胞中未观察到。又因为PVT1启动子能被MYC激活，研究团队假设PVT1-MYC融合可实现MYC表达的正反馈，避免PVT1和MYC启动子之间的过度表达，但在几种人类癌症中观察到PVT1重排和基因融合并驱动基因过度表达。  

接下来，该研究团队研究了分子间增强子-基因相互作用是否可以精确定位和干扰。该研究团队以人胃癌细胞系SNU16为研究对象，该细胞系包含两种不同的ecDNA类型:来自8号和11号染色体的MYC扩增子和来自10号染色体的成纤维细胞生长因子受体2 （FGFR2） 扩增子。H3K27ac的染色质免疫沉淀和测序显示FGFR2和MYC ecDNA之间存在分子间接触，并富集了焦点相互作用。CRISPR干扰 （CRISPRi） 靶向候选调控元件确定了与MYC或FGFR2在顺式和反式表达相关的功能元件。作为阳性对照，MYC和FGFR2启动子的CRISPR干扰会显著降低相应的基因表达。FGFR2启动子的基因敲除对MYC表达无影响，表明FGFR2蛋白下调不影响MYC表达。 最后，该研究团队在FGFR2 ecDNA上鉴定了五种能反式激活MYC的增强子，但没有鉴定出能激活FGFR2的MYC ecDNA增强子。该研究团队通过DNA FISH和体外CRISPR干扰验证了FGFR2反式增强子在98–100%的ecDNA分子上未与MYC基因共价连接。MYC启动子的CRISPR干扰降低了MYC和FGFR2的表达，表明MYC蛋白可能作为FGFR2的转录激活因子。这些数据表明，FGFR2和MYC ecDNA已被共同选择，因此两个扩增子上的增强子可协同激活MYC表达。MYC蛋白继而激活FGFR2表达。顺式和反式调节元件之间几乎没有重叠，表明分子间增强子元件是直接修饰反式中的基因表达，而不是通过下游效应。 综上所述，ecDNA的局部聚集促进了新的分子间增强子-基因相互作用和癌基因过表达。并发现与蛋白质相连的ecDNA中心能够实现分子间转录调控，并可以作为致癌基因功能和协同进化的单位，也可以作为癌症治疗的潜在靶点。未来的研究可能会发现在各种癌症类型中介导ecDNA转录活性的蛋白质，并可将其作为潜在的治疗靶点。 张元豪 ，斯坦福大学教授，HHMI研究员，美国国家科学院院士，美国艺术与科学院院士 

论文链接： https://www.nature.com/articles/s41586-021-04116-8