外泌体技术：核酸药物递送的明日之星

来源 | RNAScript

2018 年是 RNA 疗法的突破性时期，因为第一个 RNA 疗法获得了 FDA 的批准。在 COVID-19 大流行之后，RNA 疫苗在全球范围内取得了巨大的进步和认可。这些事件为整个 RNA 疗法市场的增长做出了巨大贡献。

目前，几种 RNA 疗法处于不同的发展阶段，包括 mRNA、tRNA、siRNA 和 RNAi 疗法，但主要集中在早期的临床前和临床阶段。RNA 疗法的普及之路，必须要克服的一关便是有效递送系统的建立，以解决RNA 治疗分子的早期降解、毒性和非靶标特异性等问题。

虽然LNP促进了mRNA使用的早期突破，辉瑞和Moderna等COVID疫苗制造商都采用了LNP（脂质纳米颗粒）作为递送系统，但是LNP在体内基因治疗应用方面，其递送效率并不高，存在细胞毒性等安全性隐患，在最优成分与组装工艺上还有很多急于解决的问题。所以，在LNP之外，其他新型递送系统，比如外泌体、化学修饰系统、基于聚合物的新型递送系统，都有可能成为新的突破点。

今年3月，生物技术公司 CapricorTherapeutics 在预印本 bioRxiv 上发布了其针对COVID-19的基于外泌体的多价mRNA疫苗的临床前研究积极的结果。11月，又在 JBC 杂志上与约翰·霍普金斯大学医学院合作发布外泌体在体内实验的安全性数据，综合而言，目前临床前研究的主要内容包括：

1）建立活体动物外泌体介导的mRNA表达的实时成像；

2）证明外泌体-mRNA制剂可在体内驱动功能性酶表达，为治疗性外泌体-mRNA制剂创造机会；

3）与脂质纳米颗粒（LNP）-mRNA制剂相比，外泌体-mRNA制剂具有优异的表达；

4）与LNP-mRNA治疗和LNP注射相比，外泌体mRNA治疗和外泌体注射无副作用，安全性上更胜一筹。

因此，2013年曾问鼎诺奖的外泌体技术，凭借其在生物学上的天然属性，在体内体外任何剂量下均无不良反应等优点，在未来RNA疗法的赛道上还是很值得关注的。

下文我们将从原理概念到应用空间等多个维度来细述外泌体技术的发展之路。

“迷人”的外泌体：一种在人体内具有多种功能的细胞间转运系统

外泌体，是细胞外囊泡（EV）的一类，是一种由细胞分泌并可以被受体细胞吸收的内源性小膜泡（30-150nm），它们携带核酸、蛋白质、脂质和代谢物，具有磷脂双分子层结构。现今，其特指直径在40-100nm的盘状囊泡。1983年，外泌体首次于绵羊网织红细胞中被发现， 1987年Johnstone将其命名为“exosome”。机体内大多数细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体。已发现外泌体在细胞通讯中发挥重要作用，它们具有穿过屏障（如细胞质膜、血脑屏障和胃肠道）的能力，充当全身“货物”的天然载体。此外，由于其生物相容性和特别小的尺寸，外泌体最近被认为是作为纳米颗粒缺点的合适替代品。据目前研究成果，外泌体可有效递送核酸、蛋白质、小分子和基因治疗剂等多种药物分子，实现高靶向性，达到较好的疗效。

图1：外泌体的结构和组成（图源：文献Engineering exosomes for targeteddrug delivery）

1.1、外泌体的生物学发生

外泌体起源于细胞内囊泡和早期内体的融合，早期内体又形成包含腔内囊泡（ILVs）的多泡体（MVB）。然后一些MVBs与质膜（PM）融合将ILVs释放到细胞外环境即为外泌体。精确调节外泌体分泌对于正常的细胞间通讯至关重要。外泌体通过三种主要途径进入细胞：与靶细胞的膜融合、由受体-配体相互作用驱动的内化以及内吞作用。

图2、外泌体的生物发生、分泌和细胞进入（图源：文献Engineeringexosomes for targeted drug delivery）

1.2  外泌体与细胞通讯

外泌体是细胞间通讯的媒介，影响细胞生物学的各个方面。不同的细胞通过分泌携带不同组分的外泌体实现细胞间通讯，这些外泌体被受体细胞摄取，通过物质交换或释放内含物实现物质和信号的交流。由外泌体递送到受体细胞中的蛋白质、代谢物和核酸有效地改变了它们的生物学反应。人类的生殖，妊娠和胚胎发育需要精细、动态的细胞间通信。

图3、外泌体是细胞间物质与信号交流的途径（图源：The biology, function, andbiomedical applications of exosomes）

“全能的”外泌体？外泌体与药物递送

2.1、天然的纳米载体

研究表明，外泌体可同时向受体细胞释放大量的功能分子进行细胞间通信。具有稳定性和安全性，良好的生物相容性，不具有免疫原性，具有特异性且具有良好的耐受性，并且可跨越许多物理障碍，因此外泌体是安全而稳定的内源性纳米载体，也是最好的药物传递系统选择之一，具极大的应用潜力。外泌体作为药物运载工具的研究主要以小RNA的转移为基础，尽管正在探索其他可能性。

2.1.1

miRNA

由于miRNAs作为基因表达调节因子参与了许多疾病的病理生理过程，第一批用于治疗的外泌体之一是将miR-let7a装载在Ge11肽阳性细胞内，这是一种针对表皮生长因子受体（EGFR）阳性细胞的修饰，在乳腺癌等多种肿瘤中表达从而抑制肿瘤的生长。

2.1.2

siRNA

小RNA干扰（siRNA）已成为一种很有前途的治疗策略，可以降低靶基因；许多研究表明siRNA-exosome的治疗作用，尤其是在癌症中。如针对PAK4癌基因的胰腺癌siRNA治疗。

2.1.3

长非编码RNA

长非编码RNA不仅作为生物标记物，而且由于其与miRNAs相互作用的能力而成为治疗剂。EVS携带的INcRNA治疗范围包括心血管、肌肉骨骼、胃肠和神经系统疾病等以及组织再生和修复，癌症等。

2.1.4

不同种DNA

除了siRNAs和miRNAs，基于外泌体-DNA治疗的研究也越来越多。Kanada等人设计编码药物前体转换酶的微环DNA，将其装载EVS中，用于乳腺癌治疗。

2.1.5

蛋白质

除了不同的核酸外，外泌体运输的蛋白质也被用作治疗性货物。Aspe等人的研究结果表明，外源基因介导的Survivin-T34A转染胰腺细胞株可提高吉西他滨的敏感性，提高化疗诱导细胞凋亡的效果。

2.2 工程化的外泌体---药物靶向递送

尽管外泌体是天然的新型纳米递送载体，但它可以方便地进行表面修饰从而赋予其细胞和组织特异性---靶向修饰。外泌体的表面修饰策略包括基因工程和化学修饰（图4）。化学修饰通过脂质或膜结合蛋白的化学反应或脂质-脂质相互作用安装不同的部分，例如肽、蛋白质脂质、适体、小分子、聚合物。但外泌体表面的复杂性可能会降低反应效率，反应往往缺乏对位点特异性的控制，甚至危及载体的结构和功能。基因工程将引导蛋白或多肽的基因序列与所选择的外泌体膜蛋白的基因序列融合。这种方法对于多肽和蛋白质的表面显示是有效的，然而，它仅限于基因编码的靶向基序。目前许多研究采用的都是基因工程的方法对外泌体表面蛋白进行修饰。

图4：通过基因工程或化学修饰对外泌体进行表面工程化（图源：文献Engineering exosomes for targeteddrug delivery）

2.3 外泌体的临床应用

外泌体在各种生理和病理过程中发挥着关键作用，包括癌症、妊娠障碍、心血管疾病和免疫反应。由于外泌体在临床应用中的巨大前景，已经形成了一条与外泌体研究相关的商业链，仍处于开发阶段。目前，在Clinical Trials.gov注册了100多个与Exosomes相关的临床试验，项目范围从早期的第一阶段到第二阶段（表1）。用KRASG12D siRNA治疗转移性胰腺癌患者的间充质干细胞（MSC）衍生外泌体处于Ⅰ期研究阶段。在外泌体发生过程中，外泌体能够产生内源性和位点特异性的负载物。

脂质体的负载受多种机制的调控，如ESCRT依赖途径、脂筏介导途径和神经酰胺依赖途径。外泌体作为媒介，通过传递蛋白质、脂质和RNA来改变受体细胞的状态。随着外泌体装载“货物”的功能得到越来越广泛的认识，它被认为是细胞疗法的一种潜在的替代物，也已成为药物释放的纳米平台。然而，直接将核酸加载到外泌体中可能不能有效地将功能活跃的货物运送到受体细胞中。这一现象可能是由于外源体转染效率低所致，故如何运用外泌体有效递送核酸药物具有巨大的研究价值。

表1 Exosomes in ClinicalTrials

递送核酸药物指日可待？产业处于萌芽阶段

近年来，外泌体技术领域一直在快速发展，衍生出许多以外泌体为递送载体的药物研发企业，用于治疗癌症、中枢神经系统等多种疾病。

目前致力于“天然”外泌体的公司有：Avalon、ExoCoBio、Capricor、Aegle Therapeutics、AgeX Therapeutics和United Therapeutics等；开发“工程化”外泌体的公司有：Codiak、Evox、Ilias、Aruna Bio、ReNeuron、CarmineTherapeutics、Anjarium、BrainstormCell Therapeutics、Adipomics、TriArm Therapeutics和Exocure Biosciences等。Exopharm和Avalon涉及两种类型的外泌体研发。

这些技术广泛寻求使用外泌体作为蛋白质、小分子、RNA和其它治疗剂的递送载体。2015年成立于美国马萨诸塞州剑桥的Codiak Biosciences一直是该领域最引人注目的公司之一。Aegle Therapeutics是第一家将细胞外囊泡疗法推进临床的公司，其使用专利工艺分离纯化异基因骨髓间充质干细胞（MSC）分泌的细胞外囊泡。礼来、罗氏、武田等一些大型医药企业也在通过合作的方式，来利用这一创新药物载体开发创新疗法。

图5：外泌体作为治疗工具（图源：文献The biology, function, andbiomedical applications of exosomes）

除国外研究进展外，国内9月26日，科兴生物制药股份有限公司（以下简称“科兴制药”）全资子公司深圳科兴药业有限公司与东南大学签署《关于共建细胞外囊泡递药技术产业化联合创新实验室的合作协议书》。科兴制药称，本次合作将推动国内外泌体载药技术向产业化的发展，联创实验室将获得稳定可靠的商业化规模的生产工艺和质量控制方法，并开发外泌体载药-递送-释放技术。

虽然外泌体在药物载体领域具有很大的应用潜力，但目前仍然存在很多挑战。包括保持外泌体的稳定性和功能性、外泌体的靶向治疗效果、肿瘤来源的外泌体带来的安全隐患、围绕知识产权和大规模制造的问题等。外泌体行业的发展还处在非常早期的萌芽阶段，拥有巨大的发展机遇，也存在临床转化困难与评审体系不统一的难点。

最后，我们希望随着研究的开展和技术的进步，利用外泌体作为内源性细胞衍生纳米载体的内在优势与传统纳米医学的先进设计方法相结合，释放外泌体的先天力量，以建立下一代治疗诊断纳米平台，早日造福患者。

参考文献：