Immunity综述：脓毒症的免疫学研究进展

在肠道中定植的数以万亿计的共生细菌，也在体内平衡和宿主抵御病原体入侵方面发挥重要作用。一个健康的微生物群通过直接和间接机制抵抗有害微生物的定植和入侵。微生物群直接竞争营养，维持上皮屏障功能，并产生抗菌肽。微生物群还可以调节宿主细胞产生抗菌蛋白。例如，胰岛源蛋白IIIγ的再生。该蛋白由Paneth细胞通过TLR介导的脂多糖(LPS）和鞭毛蛋白等共生微生物相关分子模式刺激上皮细胞和树突状细胞产生。短链脂肪酸(SCFAs)是微生物产生的主要代谢产物，其多效性包括其驱动单核细胞向巨噬细胞分化和抑制组蛋白去乙酰化酶-3的能力。通过这种抑制，丁酸介导巨噬细胞代谢，并进一步诱导抗菌肽的产生，以增强感染小鼠模型的抗菌活性。其他肠道细菌与肠道上皮细胞相互作用，以增强B淋巴细胞产生IgA并诱导Th17细胞分化。

肠道微生物群的破坏导致了疾病的发生。一项大型观察性研究提供了间接证据，表明肠道微生物群破坏容易导致脓毒症。肠道微生物群改变可增加肠道屏障的通透性并导致病原体向其他器官传播。肠道微生物群的破坏还会影响远端器官（如骨髓和肺），导致宿主防御感染的能力降低。通过在新生小鼠中建立大肠杆菌脓毒症模型，Deshmukh等证明微生物群可调节中性粒细胞稳态。革兰氏阴性细菌的表面表达LPS，通过TLR4诱导的信号级联激活先天淋巴样细胞产生IL-17A，从而引发血浆粒细胞集落的增加。这随后可能会刺激中性粒细胞从骨髓招募到血液中，以对抗大肠杆菌等入侵病原体。肠源性SCFAs可以影响肺部免疫环境。肠道微生物群被抗生素破坏的小鼠发生肺部链球菌感染时，细菌传播、炎症和死亡率增加。此外，肠道微生物被破坏小鼠的肺泡巨噬细胞代谢途径上调，细胞反应改变，导致吞噬肺炎链球菌的能力下降，从而导致较不明显的免疫调节反应。在严重感染的患者中，生物失调与不良预后相关。脓毒症患者肠道菌群的特点是多样性减少，厚壁菌门和拟杆菌门相对丰度降低，共生菌如粪杆菌、劳特氏菌和瘤胃球菌等数量减少，条件致病菌如大肠杆菌、肠球菌、拟杆菌、葡萄球菌等过度生长。这些改变的肠道菌群对免疫途径和宿主防御病原体入侵的影响尚不清楚。

脓毒症被认为是一种不平衡的免疫反应，病原体逃避宿主的防御机制，继续繁殖，持续地刺激和损伤宿主细胞，最终导致稳态无法恢复。在这种不平衡的反应中，许多最初被激活以提供保护的免疫机制已经变得有害，并与过度炎症和免疫抑制有关。一旦进入医院，脓毒症患者的宿主反应显示同时出现炎症和免疫抑制的迹象，部分涉及不同的细胞类型和器官系统 (图2)。危重症脓毒症患者并发高炎症状态和免疫抑制以及持续的纵向免疫系统改变的机制尚不清楚。在脓毒症中，持续的免疫刺激不仅由入侵的病原体引起，而且是由损伤相关分子模式(DAMPs)的释放引起。DAMPs激活PRRs，PRRs通常也感知PAMPs，引发免疫系统持续激活和功能障碍的恶性循环。在主要治疗措施后仍依赖重症监护的患者经常发展为慢性危重疾病，称为持续性炎症、免疫抑制和分解代谢综合征或PICS，涉及多种不同的细胞类型、器官系统和病理生理机制，伴有长时间的过度炎症，以肌肉萎缩和恶病质为主要特征的免疫抑制、骨髓生成失调和分解代谢。

   脓毒症3.0定义提出机体对感染反应失调与同时发生的不平衡过度炎症和免疫抑制有关。在与脓毒症相关的过度炎症有关的多种细胞类型和介质网络中，白细胞(中性粒细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞)、内皮细胞、细胞因子、补体产物和凝血系统激活是其突出特征(图3)。早期临床前研究引入了“细胞因子风暴”这一术语，以表明在活体动物静脉注射活菌或其胞壁成分时，全身促炎细胞因子的强烈释放。这些动物模型表明，消除促炎细胞因子（如TNF、IL-1β、IL-12和IL-18）可提供强大的保护，防止器官损伤和死亡。

 图3 脓毒症的免疫抑制机制及免疫调节干预

最近的研究表明，调控免疫检查点在脓毒症诱导的免疫抑制中的重要作用。免疫检查点蛋白是一种膜结合蛋白，作为第二信号指导对特定抗原的免疫反应(抑制或刺激)。程序性细胞死亡-1 (PD-1)是脓毒症领域广泛研究的免疫检查点蛋白。T细胞上PD-1的触发导致免疫抑制分子的释放，最终可能导致细胞凋亡。在脓毒症患者中，外周血T细胞PD-1表达增强与T细胞增殖能力减弱、医院感染发生率增加和死亡率增加相关。此外，脓毒症患者血液单核细胞和粒细胞PD-1表达增强。一项尸检研究报告PD-1在T细胞上表达增加，PD-L1和PD-L2在树突状细胞上表达增加。在脓毒症患者中，T细胞PD-1和抗原呈递细胞PD-L1的表达与淋巴细胞减少、T细胞凋亡和死亡率相关。在体外使用抗PD-1抗体治疗脓毒症患者的CD8⁺T细胞后，细胞凋亡减少，IFN-γ产生增强。此外，中性粒细胞和单核细胞PD-L1表达的增加与这些细胞的吞噬能力受损相关，抗PD -1抗体的体外应用可以提高脓毒症患者的血白细胞的吞噬能力。阻断或敲除PD-1基因可提高脓毒症小鼠的存活率，从而提出PD-1和/或PD-L1途径抑制剂可能逆转脓毒症诱导的免疫抑制的假设，并在脓毒症患者中进行了多个使用抗PD-L1抗体的I期和II期临床试验。结果表明，抗PD - L1治疗的耐受性良好，并可诱导绝对淋巴细胞计数和人单核细胞白细胞抗原- DR亚型(HLA-DR)表达的增加。虽然大量文献暗示其他免疫检查点蛋白在免疫抑制中可能的作用，但直接揭示其在脓毒症中的作用的研究很少。细胞毒性T淋巴细胞抗原-4(CTLA-4)一种表达于T细胞上负性免疫检查点蛋白，与B细胞活化抗原B7-1 (CD80)和B7-2 (CD86)结合。腹腔注射诱导脓毒症小鼠模型后，CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞和Treg细胞的CTLA-4表达增加，而抗CTLA-4抗体治疗可减少脓毒症诱导的脾脏凋亡，提高存活。抗CTLA -4治疗还降低了细菌引起的脓毒症小鼠的死亡率，同时增加了脾细胞产生IFN-γ的量。

免疫抑制的一个关键特征是单核细胞和巨噬细胞的重编程，在细菌激动剂的体外刺激下其产生促炎细胞因子的能力受损(也称为脂多糖耐受性)，而且MHC II类表达减少。脓毒症患者的外周血白细胞减少，释放促炎细胞因子如TNF、IL-1α、IL-6和IL-12能力减弱，释放抗炎介质如IL-1受体拮抗剂和IL-10没有或增强。交叉耐受性是指发现一种细菌激动剂的刺激会导致多种其他激动剂产生促炎细胞因子的能力降低。例如，体内注射LPS的人体血液白细胞在TLR2、TLR4、TLR5和TLR7配体和整个细菌的作用下，显示出体内细胞因子的产生减少。DAMPs还诱导与LPS的交叉耐受性，表明在脓毒症中诱导单个核细胞重编程的多种机制。值得注意的是，来自小鼠的研究表明，一些细胞类型没有表现出这种耐表型，甚至成为启动细胞，包括肺泡巨噬细胞、肝脏kuppfer细胞、小胶质细胞、肠道上皮细胞和皮肤中的淋巴细胞。脓毒症的一个特征是外周血单核细胞HLA-DR表达减少，这是一种公认的脓毒症诱导免疫抑制的替代标记，其与较高的院内感染发生率和死亡率相关。

通过组蛋白修饰和DNA甲基化对基因表达的表观遗传调控，有助于脓毒症中免疫细胞的重编程。基因转录是由染色质上的基因位点组织调节到转录活跃或沉默状态。组蛋白在染色质结构中塑造DNA，因此特定的组蛋白修饰可缠绕或解开染色质，使其分别无法(异染色质)或可(常染色质)进行转录。赖氨酸的组蛋白乙酰化通常支持转录，而甲基化可支持活跃的常染色质或沉默的异染色质形成，这取决于甲基化的赖氨酸。在不同的组蛋白修饰中，组蛋白3赖氨酸-4 (H3K4)和组蛋白3赖氨酸-27 (H3K27)的甲基化分别与转录的激活和抑制高度相关。脂多糖耐受巨噬细胞在编码IL-1β和TNF基因的启动子区域显示出更多的抑瘤性组蛋白修饰H3K9me2。在脓毒症患者的脂多糖耐受外周血单核细胞中也获得了类似的结果。LPS影响基因转录的表观遗传调控的分子机制包括通过NF-κB激活增加组蛋白去甲基酶KDM6B (JMJD3)的表达和在TNF和IL-1β启动子上积累组蛋白去乙酰化酶sirtuin-1。来自脓毒症患者的外周血单个核细胞和树突状细胞的单细胞转录组学揭示了一种独特的CD14⁺单核细胞群的扩增，称为MS1，它(相对于其他CD14⁺单核细胞)表现出免疫抑制表型，即通过LPS体外刺激降低了MHC II类表达，并降低了激活NF-κB和产生TNF的能力。这项研究表明，单细胞分析可能有助于深入了解脓毒症中不同的细胞表型(促炎症与免疫抑制)。

感染引起的表观遗传变化是持久的。从腹腔脓毒症中恢复的小鼠表现出树突状细胞来源的IL-12持续降低，持续至少6周，这是由组蛋白修饰影响IL-12p35和IL-12p40基因的转录引起的。此外，小鼠肺炎引起长期的表观遗传变化，使巨噬细胞耐受，并降低其吞噬抗原非特异性、无关细菌的能力。最近的小鼠研究表明，脓毒症诱导骨髓细胞的表观遗传改变。从腹腔脓毒症中恢复的小鼠，骨髓来源的巨噬细胞显示混合谱系白血病1 (Mll1)的表达下降，损害炎症基因启动子上NF-κ B结合位点的H3K4me3(激活标记)。骨髓移植实验表明，脓毒症后骨髓祖干细胞中启动的表观遗传修饰会导致外周血巨噬细胞功能的长期损害。这些结果表明，免疫抑制的变化在随后几代白细胞中持续存在，这可能与长期病残率和死亡率的预后相关。

中枢神经系统也参与了免疫反应的调节。中枢神经系统可通过神经免疫炎症反射改变周围免疫功能，包括周围组织通过传入迷走神经向中枢神经系统的感觉输入和刺激传出迷走神经导致乙酰胆碱介导的TNF产生抑制。紊乱的神经-免疫相互作用在脓毒症诱导的免疫抑制中的作用仍有待进一步的研究确定。 

在脓毒症的下一版定义（脓毒症4.0）中，脓毒症和脓毒性休克可能不再被定义为一种综合征，而是作为一组可识别的疾病，每一种疾病都以特定的细胞改变和相关的生物标志物为特征。其中的挑战是，我们不仅要区分脓毒症的病理生理，还需对患者深入观察研究，并与实验室机制研究相结合。机器学习是人工智能(AI)的一个分支，它使用数据和算法来模拟人类学习，可以帮助处理大量数据，发现有意义的信息模式，从而帮助诊断、预测和治疗脓毒症。

鉴于大部分脓毒症幸存者的健康状况受损，如认知障碍、脑功能障碍、心血管事件等，以及出院后几周到几个月的再入院率增加，有必要更加重视此类患者的远期结局，其晚期并发症导致患者生活质量降低，往往无法恢复到患病前到的状态。这些脓毒症后遗症的潜在分子机制仍不清楚。

总之，在脓毒症一词首次使用近三个世纪后，在脓毒症首次临床定义的30多年后，脓毒症仍然是一种定义不明确的综合征，不能通过特定的治疗方法治疗。在脓毒症患者中实施精准治疗，其中的免疫治疗应由宿主反应生物标志物引导，以反映可靶向的病理生理变化。这将是未来几年的主要挑战。

编译 孔凯文 薄禄龙

校订 邓小明