Cell: 肥胖塑造肿瘤微环境中的代谢并抑制抗肿瘤免疫

 

作者将5周龄的C57BL/6J小鼠随机分为正常饮食组（CD, control diet）与高脂饮食组（HFD），8-10周后HFD组的小鼠体重增长更多，且显示了肥胖相关的代谢变化（图1A）。之后，注射MC38 结直肠腺癌细胞，MC38肿瘤在HFD小鼠中生长更为迅速（图1B）。此外，作者还用另外三种不同免疫原性水平的肿瘤模型进行比较，高免疫原性的E0771乳腺肿瘤在HFD动物中生长更快（图1C）；中等免疫原性的B16黑色素瘤在HFD组中的的生长速度稍增加（图1D），而低免疫原性的Lewis肺癌的增长速度并不随饮食改变（图1E）。

为探究CD组中肿瘤生长速率的降低是否由T细胞导致，作者在TCRα敲除（TCRα-KO）小鼠中种植MC38肿瘤。TCRα-KO小鼠与野生型小鼠在高脂饮食后体重增长相似，但在TCRα-KO小鼠中CD组与HFD组的MC38肿瘤的增长速度并无区别（图1F）。

同样对于CD8+T细胞清除的小鼠而言，不同的饮食分组对肿瘤生长速率无影响（图1G）。

作者对CD与HFD组肿瘤中的细胞进行无偏倚聚类分析，识别出了16个不同的细胞群（图3B）。HFD组中的淋巴细胞显著减少，但免疫抑制性髓样细胞的相对比例无明显变化（图3C）。来自CD组肿瘤的白细胞富集糖代谢及氧化还原途径，而HFD组则富集脂肪胆固醇代谢、叶酸合成、戊糖与葡糖醛酸转换相关途径（图3D）。作者计算了两组不同细胞集的KEGG代谢特征得分（图3E-3G），亚群6（单核细胞）, 亚群8（T细胞）, 亚群10（M2 TAMs）对HFD尤为敏感。

之后作者分析了参与代谢调节和免疫活性的KEGG信号特征，HFD组T细胞亚群中趋化因子信号和T细胞受体信号都显著减少（图3H、3I）。作者又将T细胞分类进行分析，发现CD组中 CD8+T细胞中代谢途径更为富集，这些与T细胞活化相关（图3K）。

当作者对Tim3细胞毒性CD8+ T细胞进行差异表达分析时，正常饮食组富含CD8+ T细胞的前五个基因参与T细胞效应器功能，包括Gzmb、Tnfrsf9、Ifng、Ccl3和Ccl4（图3L）。总的来说，与未受刺激的T细胞相关特征往往富集在HFD组，而与受刺激的T细胞相关特征则富含在CD组（图3M）。为了确定T细胞刺激信号得分较高的细胞是否在特定代谢信号得分较高，作者计算了T细胞刺激信号与CD组和HFD组内 CD8+ T细胞的一组核心KEGG代谢途径之间的相关性。事实上，代谢途径与HFD 组内TME中的T细胞活化更显著相关（图3N）。总之，单细胞谱分析显示TME中的免疫细胞在HFD组中经历独特的代谢适应，并且差异在T细胞中是独特的，T细胞显示主要中心碳代谢途径的表达改变。 

CD8+T细胞杀伤肿瘤细胞需要直接的细胞间接触以及足够的代谢资源。因此作者试图探究肥胖是否会影响TILs在TME中的位置，以及T细胞在肿瘤中的位置是否与肿瘤内代谢生态位变化相关。作者根据标记物表达模式和代谢特征来判定细胞簇（图4A-B），使用循环免疫荧光技术（CyCIF）绘制TME中细胞位置和状态，共识别出9个不同的细胞型（图4C）。发现HFD组肿瘤中CD8 +T细胞更少且T细胞并不集中于肿瘤边缘（图4SC）。

作者发现两组糖酵解标志物(GLUT1, PKM2, LDH)分布不同（图4D）。为确定这种代谢状态的差异是否与免疫细胞的空间分布相关，作者测量了免疫细胞群与GLUT1或ACO2高表达的肿瘤区域之间的重叠，将位于肿瘤内高GLUT1或高ACO2区域的CD8+T细胞的比例(图4E和4F)与涉及相同数量CD8+T细胞的模拟零分布进行了比较(图4G)，发现CD4+和CD8+T细胞在高GLUT1区域实际分布较模拟分布显著减少（图S4F、S4G）。作者还发现HFD组较CD组，CD8+与CD4+T细胞和GLUT1重叠减少(图4H和4I)，尤其是CD8+T细胞。因此认为HFD影响了肿瘤中T细胞的浸润模式。 

在增殖、生存、产生效应功能方面，CD8+T细胞与肿瘤细胞依赖于许多同样的代谢途径。作者对GFP+ MC38 肿瘤细胞、CD8+ TILs、引流淋巴结（dLN）中的CD8+ T进行bulk RNA-seq。主成分分析显示了来自于肿瘤和dLN的T细胞，以及CD组和HFD组TILs的不同（图5A），提示肥胖所致CD8+T细胞改变为TME特有。为理解CD8+T细胞的TME特异适应性反应，作者研究了CD8+ TILs转录水平的变化，四个基因在HFD组的表达显著不同，其中三个为脂肪合成或胆固醇代谢相关ELOVL6、DGAT1、LDLRAP1（图5B）。CD8+TILs转录水平变化与肿瘤细胞不重叠(图5C-5F)，提示二者对HFD有不同的代谢适应。作者发现HFD肿瘤细胞在基因表达上向促进脂肪酸氧化（FAO）改变（图5G），而CD+ TILs并非如此（图5H）。此外，HFD组MC38肿瘤细胞的糖酵解基因转录水平比CD8+TILs下降更多(图5I和5J)。因此，肿瘤细胞和CD8+TILs对HFD的代谢适应，包括脂肪代谢的变化，都有所不同。

作者发现两个饮食组中的CD8+TILs和MC38肿瘤细胞在中性脂水平相似（图5K、5L）。

来自HFD小鼠肿瘤细胞比CD组的摄取更多的脂肪酸（图5M）。作者推断肿瘤内脂肪利用的变化会影响该微环境下CD8+T细胞的脂肪摄取。进一步的试验发现不同的饮食没有改变dLN中CD8+T细胞的基线棕榈酸酯摄入（图5N、5O），但HFD组中的, CD44+ CD8+ TILs比CD组摄取的棕榈酸酯更少（图5N、5P）。B16-OVA-RFP及E0771肿瘤中也有类似的发现（图5Q-5S）。因此，肿瘤细胞适应并增加脂肪酸利用，而CD8+T细胞没有增加利用。肿瘤细胞脂肪酸摄取增强可能导致在TME中的T细胞缺少脂肪酸。对于在体外缺少脂肪酸的培养基中被激活的初始CD8+T细胞，在有脂肪酸补充时能更好地增殖（图5T-U）。相反，补充游离脂肪酸并不影响MC38肿瘤细胞的增殖（图S5J）。综上，TME中不同细胞群对肥胖有不同的反应，导致免疫细胞和肿瘤细胞对脂肪酸利用的不同。 

作者发现，脂肪酸代谢和氧化磷酸化是HFD肿瘤细胞中最富集的代谢途径；此外，相对于CD，HFD中的IFNγ反应降低，这可以通过CD8+T细胞浸润的减少来解释（图6B）。HFD通过诱导转运体（SLC27A1）、脂肪酸结合蛋白（FABP5）和参与线粒体氧化的蛋白质（CPT1A、ACSM3、ACADVL、ETFB、ECHS1）（图6C、6D和6F）来支持肿瘤中的脂肪利用。HFD组中催化不可逆和（或）限速步骤的糖酵解酶被下调（图6C-6F）

作者比较了血浆、GFP+ MC38肿瘤细胞、肿瘤间质液（TIF）中的脂质构成。HFD对血浆和TIF中脂质的影响更大（图S6F-S6H），HFD组和CD组所有脂质的TIF/血浆比成正相关，甘油三酯（TAG）和甘油二酯（DAG）在对角线外，在去除了这两类脂后HFD组和CD组相关性更好，提示DAG和TAG是HFD组TME中脂质主要的不同（图S6I-S6N）。TAG和DAG中的前四名（按峰值计）在HFD的TIF中显著富集，但在血浆中没有富集（图6G-6J）。 

作者发现HFD重新编程TME以增强肿瘤中的脂肪摄取，因此假设这些HFD诱导的肿瘤细胞脂肪代谢的变化可能会影响TME中的游离脂肪酸（free fatty acids，FFAs）可用性和CD8+T细胞的功能，并进一步假设阻止HFD诱导的代谢改变可能会恢复CD8+T细胞的反应并抑制HFD组肿瘤生长的增加。

HFD增加了许多FFAs在循环中的水平，包括棕榈酸和油酸（C16：0和C18：1）（图7B、7C）。而与CD组相比，HFD组TIF的局部FFA水平降低（图7D）。PHD3过表达对CD组TIF的FFA水平无显著影响（图7E），但HFD组中一些FFA有所增加（图7F）。肿瘤细胞PHD3过表达足以恢复TME中棕榈酸盐的可用性（图7G）。

因此，恢复肿瘤细胞中PHD3表达能改变TME中的营养可用性。

肿瘤细胞PHD3过表达显著增加HFD组CD8+T细胞浸润（图7J），HFD组中PHD3过表达（PHD3-OE）较之对照（EV）显著减缓肿瘤的生长（图7K）。在TCRa-KO小鼠和CD8+T细胞清除的小鼠中PHD3过表达并不减缓肿瘤生长（图7L、7M）。这些数据表明，在MC38肿瘤细胞中保持PHD3高表达可以改善HFD小鼠的抗肿瘤T细胞反应，并减轻HFD对抗肿瘤免疫的影响。

作者分析了TCGA（The Cancer Genome Atlas）中结肠腺癌(COAD)RNA-seq数据集和相应的BMI数据，在BMI≥30kg/m2的肥胖患者中，PHD3的表达明显较低（图7N），COAD患者的癌组织中PHD3表达较正常组织减少（图7O）。此外，严重肥胖（BMI≥35kg/m2）患者肿瘤中CD8+T细胞浸润减少（图7P）。以PHD3表达为10%或20%作为切割点，将患者样本分为高PHD3或低PHD3组。然后，根据CD8+基因特征得分，将患者样本分为免疫学上的“热”、“中间”或“冷”类别（图7Q）。在COAD冷肿瘤中PHD3表达更低（图S7N），在其他类型的肿瘤中，低PHD3样本也更多出现于冷肿瘤中（图S7O）。

这些数据表明，PHD3的下调发生在人类癌症中，并与免疫力的降低有关。