富马酸二甲酯激动Nrf2调控Drpl相关线粒体裂变在糖尿病大鼠心肌缺血/再灌注损伤中的作用

徐桂萍 朱倩倩 王晓丽 闫强

新疆维吾尔自治区人民医院麻醉科，乌鲁木齐 830001

国际麻醉学与复苏杂志,2021,42(11):1143-1149.

DOI：10.3760/cma.j.cn321761-20210713⁃00406

 基金项目 

国家自然科学基金（81860345）

ORIGINAL ARTICLES

【论著】

本研究拟通过建立心肌缺血/再灌注损伤（MI/RI）模型，观察核因子E2相关因子2（Nrf2）、线粒体动力相关蛋白1（Drp1）及线粒体变化，探究MI/RI的发生机制及富马酸二甲酯（DMF）的保护机制。

1 材料与方法      

1.1　实验动物

健康、清洁级、雄性SD大鼠，体重200~240 g。

1.2　分组及处理

随机将60只糖尿病大鼠分为4组（每组15只）：假手术组（S组）、心肌缺血/再灌注组（MI/R组）、DMF+心肌缺血/再灌注组（R组）、DMF+ML385+心肌缺血/再灌注组（RE组）。R组、RE组术前7 d进行DMF25 mg/kg灌胃，1 次/d，连续7 d；S组与MI/R组予等容量生理盐水灌胃。RE组于缺血前30 min腹腔注射ML38530 mg/kg。各组大鼠分别于给药干预前、给药干预后、实验开始前尾静脉采血测定空腹血糖和体重。

1.3　糖尿病大鼠模型制备

健康雄性SD大鼠，高脂饮食（基础饲料60%、猪油10%、白糖10%、胆固醇19%、食用盐0.5%、香油0.5%）喂养4周，禁食12 h后1%链脲佐菌素柠檬酸缓冲液30 mg/kg一次性腹腔注射，之后尾静脉采血测定空腹血糖，空腹血糖≥16.7 mmol/L，并出现糖尿病“三多一少”症状为2型糖尿病大鼠模型制备成功。

1.4　MI/RI模型制备

各组大鼠禁食、禁饮12 h，腹腔注射1%戊巴比妥钠50 mg/kg麻醉，仰卧位固定行气管插管后，连接小动物呼吸机行机械通气，连接监护仪连续监测Ⅱ导联ECG。大鼠取右侧卧位，于左胸第4、5肋间处开胸，撑开器暴露心脏，切开心包，待心跳稳定15 min后于显微镜下在左心耳下缘2 mm处，使用6‑0缝线，用一带有凹槽的乳胶管垫于血管和结扎线之间，对大鼠冠状动脉前降支进行结扎，ECG显示ST段弓背向上抬高或T波高耸、心脏表面变为苍白色表明缺血成功。缺血30 min后剪断结扎线取出乳胶小管，恢复冠状动脉血流，缺血部位心肌颜色恢复鲜红色、抬高的ST段下降50％以上或高耸的T波下降为模型建立成功，再灌注时长为120 min。S组大鼠只穿线不结扎。

1.5　心脏功能监测

采用小动物超声仪监测4组大鼠心率、左心室收缩压（LVSP）、左心室射血分数（LVEF）和左心室短轴缩短率（FS）。

1.6　生化检测

各组15只大鼠于再灌注120 min，经腹主动脉取血3 ml，离心10 min，离心后取上清液，采用ELISA试剂盒检测血清乳酸脱氢酶（LDH）、肌酸激酶同工酶（CK‑MB）、心肌肌钙蛋白I（cTnI）含量。

采血后，各组随机取5只大鼠取左心室心肌组织，液氮速冻后于−80 ℃冰箱保存。试剂盒测定丙二醛（MDA）、活性氧自由基（ROS）含量及超氧化物歧化酶（SOD）活性。

另取部分左心室缺血区组织检测Nrf2、Drp1 mRNA及蛋白水平。

1.7　RT‑PCR法检测心肌Nrf2、Drp1 mRNA水平

采用RNA提取试剂盒提取心肌组织RNA，将RNA逆转录合成cDNA后行基因扩增，严格按RT‑PCR说明书进行操作。以β‑actin为内参。

1.8　Western blot检测

左心室心肌组织100 mg，总蛋白提取试剂盒提取总蛋白，BCA法定量。取40 μg总蛋白进行电泳，电转移，用含5%脱脂奶粉的TBST（封闭液）室温摇床封闭2 h。分别加入相应的一抗（Nrf2、Drp1，稀释度均为1∶1 000），4 ℃孵育过夜。TBST漂洗5次，5 min/次，加入二抗，37 ℃孵育2 h，TBST漂洗5次，5 min/次，ECL显影。用BandScan分析胶片灰度值，以目的蛋白条带与β‑actin条带灰度值的比值计为目的蛋白水平。

1.9　组织病理学及线粒体检测

采血后，各组随机取5只大鼠取左心室心肌组织，光镜下观察心肌病理学结果，电子显微镜评估心肌线粒体形态学改变。

心肌组织置于4％多聚甲醛中固定，乙醇脱水，石蜡包埋，4 μm切片，行常规H‑E染色，光镜下（×400）观察心肌病理学结果。

用刀片将大鼠心肌组织切成0.5 cm3小块，3%戊二醛磷酸缓冲液固定，按电镜常规制作超薄切片，20 000倍观察和拍照。

1.10　心肌梗死面积测定

各组余5只大鼠再灌注120 min采血后重新结扎冠状动脉前降支，股静脉注射1%伊文思蓝染色液3 ml，全身皮肤变蓝后处死大鼠并取下心脏，PBS多次冲洗清洗，吸水纸吸干后，放入−20 ℃冰箱冷冻120 min后取出，垂直于心脏长轴2 mm切片，置于2，3，5‑三苯基氯化四氮唑（TTC）缓冲液中，37 ℃恒温培养箱避光孵育30 min，再将切片置于4%多聚甲醛中固定30 min后拍照，采用Image Proplus 6.0测量心肌梗死区域。用梗死区占缺血危险区的百分比表示心肌梗死面积。

2 结 果      

2.1　血糖及体重

干预前和干预后各组糖尿病大鼠体重及血糖差异均无统计学意义（P>0.05，表1）。

2.2　心脏功能

与S组比较，MI/R组、R组和RE组心率、LVSP、LVEF、FS明显下降（P<0.05）；与MI/R组比较，R组心率、LVSP、LVEF、FS明显增加（P<0.05）；与R组比较，RE组心率、LVSP、LVEF、FS下降（P<0.05）。见表2。

2.3　心肌细胞损伤标志物LDH、CK‑MB、cTnI

与S组比较，MI/R组、R组、RE组大鼠心肌损伤标志物LDH、CK‑MB和cTnI含量明显增加（P<0.05）；与MI/R组比较，R组大鼠心肌损伤标志物LDH、CK‑MB和cTnI含量降低（P<0.05）；与R组比较，RE组大鼠心肌损伤标志物LDH、CK‑MB和cTnI含量增加（P<0.05）。见表3。

2.4　心肌组织MDA、ROS含量及SOD活性

与S组比较，MI/R组、R组、RE组MDA、ROS含量增加，SOD活性下降（P<0.05）。与MI/R组比较，R组MDA、ROS含量降低，SOD活性增加（P<0.05）。与R组比较，RE组MDA、ROS含量增加，SOD活性下降（P<0.05）。见表4。

2.5　心肌H‑E染色

光镜下可见S组心肌细胞形态正常，心肌纤维排列整齐，心肌细胞无水肿，未见炎性细胞浸润；MI/R组和RE组心肌细胞形态学改变，心肌纤维排列杂乱，部分可见断裂，细胞核固缩现象与炎性细胞浸润明显；R组心肌细胞形态较正常，无片状心肌纤维断裂现象，可见少量炎性细胞浸润，偶见核固缩，病理损伤较MI/R组、RE组减轻。见图1。

2.6　心肌梗死面积

S组心肌梗死面积为0；与S组比较，MI/R组、R组、RE组心肌梗死面积明显增加（P<0.05）；与MI/R组比较，R组心肌梗死面积减少（P<0.05）；与R组比较，RE组心肌梗死面积增加（P<0.05）。见图2。

2.7　心肌组织 Nrf2、Drp1 mRNA水平

与S组比较，MI/R组、R组、RE组心肌Nrf2、Drp1 mRNA相对表达上调（P<0.05）；与 MI/R组比较，R组大鼠心肌Nrf2 mRNA相对表达上调，Drp1 mRNA相对表达下调（P<0.05），RE组大鼠心肌Nrf2、Drp1 mRNA水平差异无统计学意义（P<0.05）；与R组比较，RE组大鼠心肌Nrf2 mRNA相对表达下调，Drp1 mRNA相对表达上调（P<0.05）。见表5。

2.8　Nrf2、Drp1蛋白水平

Western blot结果显示，与S组比较，MI/R组、R组、RE组Nrf2及Drp1蛋白水平上调（P<0.05）。与 MI/R组比较，R组Nrf2蛋白水平上调，Drp1蛋白水平下调（P<0.05）。与R组比较，RE组Nrf2蛋白水平下调，Drp1蛋白水平上调（P<0.05）。见图3。

2.9　电镜下心肌线粒体超微结构

S组线粒体大小形态正常，内部排列有序，结构清晰完整。与S组比较，MI/R组、R组、RE组均有不同程度破坏，膜结构溶解，肌纤维排列紊乱，线粒体肿大，空泡化程度重。与MI/R组比较，R组线粒体裂变程度降低，更趋向于融合，空泡化程度减轻；与R组比较，RE组使用Nrf2抑制剂ML385后，线粒体裂变程度增加，明显肿大，可有膜破裂。见图4。

3 讨 论      

本研究结果显示，与S组比较，MI/R组大鼠心肌细胞MDA、ROS含量增加，SOD活性下降，心肌损伤标志物LDH、CK‑MB和cTnI水平均增加，并发生明显心肌梗死；使用DMF处理后R组大鼠心肌细胞MDA、ROS含量降低，SOD活性增加，LDH、CK‑MB和cTnI水平降低，心肌梗死面积减少。表明DMF在一定程度上可以减轻心肌损伤，在MI/RI中起到保护作用。

本研究中，S组Nrf2 mRNA及蛋白均少量表达，心肌缺血/再灌注后Nrf2 mRNA及蛋白水平均增加，表明MI/R可以激活Nrf2的表达，但内源性的Nrf2不足以抵抗心肌缺血/再灌注所导致的心肌损伤。经过DMF处理后，Nrf2 mRNA及蛋白水平进一步增加，心肌病理损伤减轻，进一步表明DMF发挥心肌保护作用与Nrf2的表达增强有关。同时，使用Nrf2抑制剂ML385处理后，激活Nrf2所产生的心肌保护作用被部分抵消。本研究通过PCR和蛋白印迹分析发现，MI/R组糖尿病大鼠心肌Drp1 mRNA及蛋白水平增强，此外，在电子显微镜下我们观察到心肌缺血/再灌注后糖尿病大鼠心肌线粒体受到不同程度的破坏，表明Drp1上调调控的线粒体裂变与心肌损伤相关。此外，经DMF处理后糖尿病大鼠心肌中Nrf2 mRNA及蛋白水平增加的同时，Drp1 mRNA及蛋白水平均下降，线粒体破坏减轻，裂变程度降低、线粒体更趋向于融合。为明确Nrf2与Drp1的关系，本研究进一步使用Nrf2抑制剂ML385处理后，我们观察到Nrf2 mRNA及蛋白水平下降的同时，Drp1 mRNA及蛋白水平有所增加，线粒体裂变程度增加，抑制了DMF的心肌保护作用。因此，DMF在MI/RI中发挥心肌保护作用可能与激活Nrf2调控Drp1表达介导线粒体裂变有关。

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